馬雁南，楊小頎，馬曉軍，胥 冰，劉 洋

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖科，陜西 咸陽 712046；4.中國(guó)人民解放軍32144部隊(duì)，陜西 渭南 714000）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（RSA） 其發(fā)病率約占妊娠女性總數(shù)的1%～5%[1]，其高發(fā)率嚴(yán)重影響育齡女性生殖健康及家庭和諧。黃芩具有清熱安胎的作用[2-4]，其主要成分之一黃芩苷的安胎效果已被證實(shí)[5-7]，但其是否通過母胎界面免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)發(fā)揮作用，進(jìn)而有效制約RSA的發(fā)生，鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選用復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠模型[8-10]，在黃芩苷干預(yù)下經(jīng)ELISA測(cè)試方法分別檢測(cè)子宮組織中4種細(xì)胞因子：IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10及孕酮含量變化情況，并對(duì)受孕小鼠子宮組織切片HE染色分析，旨在研究黃芩苷是否及如何通過調(diào)節(jié)子宮局部母-胎界面免疫狀態(tài)來發(fā)揮安胎作用，進(jìn)而制約流產(chǎn)的發(fā)生，從免疫學(xué)角度來探討黃芩苷的安胎機(jī)理，為黃芩“清熱安胎”理論提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑及藥品 黃芩苷（Baicalin），購(gòu)于博奧生物醫(yī)藥科技有限公司；蛋白酶抑制劑（Aprotinin），Biosharp產(chǎn)品。小鼠INF-γ、IL-2、IL-4、IL-10、孕酮ELISA測(cè)試盒，BioSource產(chǎn)品。

1.1.2 儀器設(shè)備 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Neofuge 13R），上海力申科學(xué)儀器有限公司。直立式超低溫冰箱（MDF-382E），SANYO Electric Biomedical Co.Ltd，Janpan。酶標(biāo)儀（318MC），上海三科儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)組別處理 1）模型處理：8周齡SFP級(jí)CBA/J雌鼠30只，體質(zhì)量20～22 g，DBA/2雄鼠10只，BALB/C雄鼠5只，由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（滬）2013-0016。常規(guī)飼養(yǎng)，自由采食飲水，每日光照時(shí)間12 h。經(jīng)觀察臨床健康，適應(yīng)環(huán)境1周后，雌雄鼠交換墊料，1～2 d后肉眼觀察結(jié)合陰道涂片法檢查雌鼠發(fā)情情況。若陰道外觀紅潤(rùn)或腫脹，開口較大，則初步判斷為發(fā)情期，行陰道涂片檢查確認(rèn)。將發(fā)情的CBA/J雌鼠，與DBA/2雄鼠按2:1比例合籠交配，制造復(fù)發(fā)性流產(chǎn)模型；與BALB/C雄鼠按2:1比例合籠，制造正常妊娠模型。次晨檢出陰栓者，記為孕0 d。2）藥物配制：①黃芩苷液：黃芩苷10 mg，d2H2O 4 mL，配制濃度2.5 mg/mL。②苦味酸飽和水溶液：苦味酸1.5 g +蒸餾水100 mL。③Bouin’s：苦味酸飽和水溶液75 mL +甲醛25 mL。④蛋白酶抑制劑工作液：蛋白酶抑制劑2 mg溶解于甲醇 13.33 mL，得工作濃度 0.15 μg/μL。⑤ PBS：KCL 0.2 g + Na2HPO4.12H2O 1.44 g + KH2PO40.24 g，加蒸餾水800 mL溶解，調(diào)pH值7.4，定容至1 000 mL。3）模型分組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為正常妊娠組（A組：CBA/J雌鼠與BALB/C雄鼠交配）和實(shí)驗(yàn)組（CBA/J雌鼠與DBA/2雄鼠交配制造的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)模型），實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分為模型對(duì)照組（B組）和黃芩苷治療組（C組），每組10只。A組自孕1 d開始連續(xù)灌胃磷酸鹽緩沖液0.4 mL/（d·只），共14 d。B組均自孕1 d開始連續(xù)灌胃磷酸鹽緩沖液0.4 mL/（d·只），共14 d；C組自孕1 d開始連續(xù)灌胃，黃芩苷0.4 mL/（d·只），共14 d。藥物劑量參考常用最佳量為實(shí)驗(yàn)藥物劑量[11-12]。孕14 d處死所有孕鼠。4）實(shí)驗(yàn)取樣：孕滿14 d頸椎脫臼法處死孕鼠。打開腹腔，暴露子宮，觀察子宮生長(zhǎng)情況，記錄胚胎著床數(shù)目和胚胎吸收數(shù)目。發(fā)育正常的子宮胚胎形狀似串珠，色澤光鮮，大小均一，胚胎的中間部位可見紅色條索狀胎盤。而發(fā)育異常子宮呈黑紫或褐色，內(nèi)可見陳舊性出血或伴血凝塊，體積明顯變小，部分胚胎萎縮或消失，解剖鏡下觀察，模糊一片無正常胚胎結(jié)構(gòu)。而后在冰盒上完整取出子宮，除去系膜及脂肪組織后稱重?？v向剖開子宮，完整剝離胚胎后稱量子宮凈重。剪下右側(cè)子宮，稱重后加入pH = 7.4的磷酸鹽緩沖液（內(nèi)含6倍量0.75 μg/mg的蛋白酶抑制劑），立即在低溫環(huán)境中進(jìn)行勻漿，4 ℃，12 000 r/min，離心15 min。取上清液分裝，- 80 ℃凍存，用于ELSIA測(cè)定INF-γ、IL-2、IL-4、IL-10的含量。左側(cè)子宮剪下后立即放入Bouin’s液中固定，然后浸入70%乙醇中，用于HE染色。

1.2.2 測(cè)定各組別相關(guān)研究因素含量 遵照試劑盒說明書操作，反應(yīng)終止后，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度（OD）值，利用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品OD繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10細(xì)胞因子及孕酮的含量，并在電子顯微鏡下觀察各組別子宮組織切片HE染色差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)使用Excel 2 000和SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，單變量方差分析組間差異顯著性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x± s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組流產(chǎn)率、胚胎吸收率比較 見表1。

表1 各組妊娠率、胚胎吸收率比較（n = 10） %

2.2 各組子宮組織中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10細(xì)胞因子含量比較

2.2.1 子宮組織中Th1型細(xì)胞分泌細(xì)胞免疫因子IFN-γ、IL-2含量比較 見表2。

2.2.2 子宮組織中Th2型細(xì)胞分泌細(xì)胞免疫因子IL-4、IL-10含量比較 見表3。

2.3 各組子宮組織中孕酮含量比較 B組中P4的含量與A組相比差異顯著（P＜0.05）。C組中P4的含量與A組相比差異不明顯（P＞0.05）。C組與B組相比差異顯著（P＜0.05），見表4。

表2 子宮組織中Th1型細(xì)胞分泌細(xì)胞免疫因子IFN-γ、IL-2 的含量比較（x± s ，n = 10） pg/mL

表3 子宮組織中Th2型細(xì)胞分泌細(xì)胞免疫因子IL-4、IL-10含量比較（x± s ，n = 10） pg/mL

表4 各組子宮組織中孕酮的含量比較（x± s ，n = 10） pg/mL

2.4 各組子宮大體組織及切片HE染色分析 3組子宮胚胎大體標(biāo)本結(jié)果：A組子宮胚胎形狀似串珠，色澤光鮮，大小均一，胚胎的中間部位可見紅色條索狀胎盤；B組子宮內(nèi)可見陳舊性出血或伴血凝塊，體積明顯變小，部分胚胎萎縮或消失；C組子宮色澤紅潤(rùn)，大小一致，胚胎發(fā)育正常。

3組HE染色結(jié)果：A組子宮腺體清晰可見，子宮蛻膜細(xì)胞排列整齊，大小均勻，數(shù)量正常；B組蛻膜細(xì)胞碎裂，數(shù)量明顯減少，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，局部難以見子宮腺體；C組蛻膜細(xì)胞明顯增多，排列整齊，核增大，腺體清晰可見。3組切片HE染色表現(xiàn)出明顯懸殊。

3 討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（RSA）是婦科一種常見且多發(fā)的疾病，其高發(fā)生率和高危害性已嚴(yán)重影響育齡女性生殖生育健康，被社會(huì)廣泛關(guān)注[11-13]。劉志蘭等[14]對(duì)臨床1 101例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病例研究分析后認(rèn)為，RSA經(jīng)典四大明確病因中，影響力從高到低依次為自身免疫異常（17.80%）、夫妻染色體異常（7.63%）、內(nèi)分泌異常（5.36%）及解剖異常（3.73%）。隨著現(xiàn)代臨床檢測(cè)手段的不斷升級(jí)和生殖免疫研究的精準(zhǔn)化深入，位列首位的致使RSA發(fā)生的自身免疫因素正逐步向母胎界面免疫微環(huán)境的耐受調(diào)節(jié)機(jī)制研究方面聚焦，因生理性妊娠過程依賴于母胎間免疫耐受的建立與維持，即母體免疫系統(tǒng)對(duì)胚胎遺傳的父系抗原所產(chǎn)生的反應(yīng)是免疫支持和防護(hù)而非攻擊，而一旦這種保護(hù)性免疫機(jī)制失調(diào)，勢(shì)必導(dǎo)致流產(chǎn)等現(xiàn)象發(fā)生。研究[15-16]證實(shí)，若母胎界面免疫微環(huán)境中攻擊型Th1細(xì)胞分泌細(xì)胞免疫因子明顯強(qiáng)于防護(hù)型Th2細(xì)胞，即打破經(jīng)典Th1/Th2平衡理論，則致使胚胎丟失，亦即發(fā)生流產(chǎn)行為。相關(guān)研究[17]表明，如缺乏IL-4，則無Th2型反應(yīng)，其流產(chǎn)率及胚胎吸收率也驟然上升，可見子宮局部母-胎界面免疫狀態(tài)穩(wěn)定對(duì)RSA的重要意義。

從本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果可發(fā)現(xiàn)：在黃芩苷干預(yù)治療作用下，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠模型的流產(chǎn)率及胚胎吸收率明顯降低，安胎效果幾乎與正常妊娠模型相似，充分證明黃芩苷可有效制約復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生；同時(shí)，經(jīng)ELSIA法測(cè)定受孕子宮勻漿組織中INF-γ、IL-2及IL-4、IL-10 4種免疫因子含量可見：黃芩苷作用下既明顯抑制Th1型細(xì)胞分泌INF-γ、IL-2因子，又明顯促進(jìn)Th2型細(xì)胞分泌IL-4、IL-10因子，使得母胎界面免疫微環(huán)境的Th2型細(xì)胞因子的整體水平上調(diào)，促使Th1/Th2平衡偏向Th2型，抑制RSA發(fā)生，有力證明了黃芩苷通過調(diào)節(jié)子宮局部母-胎界面免疫狀態(tài)這一機(jī)制來制約復(fù)發(fā)性流產(chǎn)行為；另外，黃芩苷也明顯提升了子宮局部孕酮的含量水平，影響并保護(hù)蛻膜細(xì)胞及子宮腺體正常發(fā)育，為安胎提供了確鑿科學(xué)依據(jù)。

本文通過科學(xué)實(shí)驗(yàn)不僅證明黃芩苷通過調(diào)節(jié)子宮局部母-胎界面免疫狀態(tài)機(jī)制，抑制Th1型免疫細(xì)胞，促進(jìn)Th2型途徑發(fā)揮良好安胎作用，并能提升孕酮激素水平，有效降低RSA發(fā)生率，實(shí)驗(yàn)成果較明顯。相信在進(jìn)一步加強(qiáng)臨床結(jié)合基礎(chǔ)研究的將來，黃芩苷在治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中必會(huì)有更大突破性進(jìn)展。