李 月，陳 培，劉 麗

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040）

目前，不孕癥的發(fā)生率在我國為7%～10% 。而不孕原因中盆腔因素則占35%，其中以慢性輸卵管炎導(dǎo)致的不孕癥較為常見[1]。在治療方法上西醫(yī)則用抗生素、輸卵管通液術(shù)、宮腔鏡、腹腔鏡等治療，存在易反復(fù)發(fā)作，且創(chuàng)傷性較大等不良反應(yīng)；而中醫(yī)藥治療則毒副作用較小，創(chuàng)傷性較小并且能有效減輕臨床癥狀。近年來，在臨床上應(yīng)用膈下逐瘀湯加減方治療氣滯血瘀型輸卵管炎取得了較好療效。本研究應(yīng)用雌性大鼠建立氣滯血瘀型輸卵管炎性模型，在造模成功后第29天同時分組給予膈下逐瘀加減方和康婦炎膠囊治療比較其對TNF-α蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8～12 周齡健康性成熟雌性 Wistar

大鼠48只，體質(zhì)量平均為200 g ，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物合格證編號：SCXK（京）

2016-0001。標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境（室溫19～24 ℃），標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水，予以每日早8: 00到晚8: 00人工燈光照明。大鼠飼養(yǎng)房每日1次紫外線燈消毒 。

1.1.2 試驗藥品與試劑 膈下逐瘀顆粒藥物組成：牡丹皮15 g，赤芍20 g，延胡索 20 g，桃仁 15 g，鱉甲15 g，烏藥15 g，川芎15 g，香附20 g，枳殼15 g，地龍15 g（由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科提供）?？祴D炎膠囊，山東步長神州制藥有限公司，批號：150530。

1.1.3 實驗菌種 4 × 109金黃色葡萄球菌懸液0.1 mL，菌號為 FSCC223005；10%水合氯醛，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20160709。

1.1.4 實驗儀器 TNF-α試劑盒（購自武漢博士德生物工程有限公司）；JTC-1 型驚覺及痛覺實驗交流刺激儀（成都儀器廠）；UC4-75 電鈴（白云電子器材廠）。

1.2 方法 經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將48 只Wistar雌性大鼠隨機分為4組，每組12只，分別為正常組、模型組（氣滯血瘀型輸卵管炎組）、成藥組（康婦炎膠囊組）、中藥組（膈下逐瘀湯加減方組）。造模前用電子稱稱重，隨即編號，正常對照組予以正常喂養(yǎng)，連續(xù)4周；模型組10%水合氯醛按0.4 mL/100 g經(jīng)腹腔注射麻醉后，將大鼠臥式平放，兩側(cè)脊柱術(shù)區(qū)剃毛，然后碘伏消毒，取肋緣過腎區(qū)0.5 mL近脊柱側(cè)旁開 1 cm 行橫切口。打開腹腔，撥開其他組織，暴露輸卵管，然后將4 × 109金黃色葡萄球菌懸液 0.1 mL 注射到輸卵管后，逐層縫合肌層、皮層。手術(shù)完畢后再次進(jìn)行皮膚消毒，然后另一側(cè)輸卵管同樣方法操作，術(shù)畢放于鼠籠內(nèi)，等待蘇醒之后給予正常飼養(yǎng)，共 4周；1周給予聲光電刺激：比如大鼠足底 24～35 V 電擊刺激，噪聲刺激（等級為3級），頻率為 1～3 kHz 強度的閃爍光刺激，以上刺激每8～15 min 1次；夾尾：用長鑷夾大鼠鼠尾，使其與其他大鼠撕打（撕打時可松開鑷子），1次/h，傾斜鼠籠2 h，1次/d[2]，連續(xù)3周；造模后第29天開始灌胃給藥，成藥組為康婦炎膠囊懸液0.064 g/kg，灌胃體積為1 mL/100 g，連續(xù)灌胃28 d，中藥組為膈下逐瘀湯加減方0.064 g/kg，灌胃體積為1 mL/100 g，連續(xù)灌胃28 d。

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1 大鼠行為及宏觀體征觀察 觀察造模期間和造模后各組大鼠的活動情況、精神狀態(tài)、皮毛、色澤、舌質(zhì)、大小便和飲食情況等。

1.3.2 血清TNF-α水平測定 于第29天，術(shù)前做好相關(guān)準(zhǔn)備，每組隨機選取10只大鼠，水合氯醛（10%，3 mL/kg）麻醉大鼠后，分離腹主動脈，經(jīng)腹主動脈取血后，取輸卵管用于TNF-α蛋白表達(dá)測定。依照ELISA 試劑盒操作規(guī)程測定 TNF-α蛋白水平。

1.3.3 組織病理學(xué)觀察 進(jìn)行輸卵管標(biāo)本的采集，肉眼觀察組織形態(tài)變化后，在10%中性甲醛溶液中固定，常規(guī)切片染色后，觀察輸卵管有無病理改變及改變程度的輕重。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間比較用方差分析，計數(shù)資料比較使用χ2檢驗，等級資料分析用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為及宏觀體征變化比較 模型組與正常組相比，模型組大鼠出現(xiàn)爪、尾、舌從紅到紫的轉(zhuǎn)變、活動量減少、精神異常、呼吸減少、攻擊性增強、進(jìn)食減少、糞便不成形、體質(zhì)量增長緩慢等現(xiàn)象。

2.2 各組大鼠組織病理學(xué)變化比較 模型組與正常組相比輸卵管有病理改變及改變程度不同：模型組出現(xiàn)血管壁充血腫脹，管壁增厚，變硬，管腔阻塞不通，管體增粗，輸卵管常與卵巢黏連，輸卵管的傘端部分有部分或者完全的阻塞，閉鎖，黏膜皺襞向內(nèi)卷曲，管腔與盆腔黏連程度重。

2.3 各組大鼠血清 TNF-α水平變化比較 與正常組相比較，模型組TNF-α蛋白表達(dá)強度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，中藥組和成藥組TNF-α表達(dá)強度有顯著差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。同成藥組比較，中藥組TNF-α表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。膈下逐瘀湯加減方抑制輸卵管上皮TNF-α蛋白表達(dá)強度優(yōu)于成藥康婦炎膠囊。見表1。

表1 各組大鼠血清TNF-α水平變化比較（n = 6）

3 討論

由于社會醫(yī)療保障體系及法律保障體系的缺失，臨床試驗機構(gòu)和臨床試驗的申辦方淪為臨床試驗中的弱勢群體。如若能做好相關(guān)病證結(jié)合的動物模型，即可在動物身上做實驗，然后應(yīng)用于臨床，既能促進(jìn)該疾病的進(jìn)一步研究，同時也能保障臨床試驗機購的相關(guān)權(quán)益[3]。故為進(jìn)一步探討氣滯血瘀型輸卵管炎的作用機制，可應(yīng)用大鼠造出氣滯血瘀型輸卵管炎模型，雖然靈長類動物基因組與人類相似度較高，但其價格昂貴，物種稀有，實驗周期長，飼養(yǎng)條件高，故靈長類動物模型的使用受到限制，所以使用大鼠作為實驗對象[4]，即用金黃色葡萄球菌注射到輸卵管后造成輸卵管炎癥模型[5]，慢性輸卵管炎性模型成功后再此基礎(chǔ)上進(jìn)行聲、光、電、夾尾的刺激，大鼠長期情志不舒，氣機不暢，無力推動血行，日久發(fā)展為血瘀，遂建成氣滯血瘀的模型[6]。輸卵管炎癥模型的成功建立再結(jié)合氣滯血瘀的模型，建立與證候相一致的動物模型。這種病證結(jié)合造模的方法，既在西醫(yī)病理造模的基礎(chǔ)上疊加中醫(yī)證候[7]。病證結(jié)合模型既有西醫(yī)明確的指標(biāo)評價支持，又引入中醫(yī)的辨證思想。這更符合臨床診治的情況，更有利于探討疾病的病理變化在中醫(yī)特定證型中的表現(xiàn)，同時也方便用于西醫(yī)評價標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評估。從而可以更好的研究疾病的發(fā)病機制并找到有效的治療方法。輸卵管炎性不孕，歸屬于中醫(yī)學(xué)婦人腹痛、不孕、斷緒等病證范疇。主要病機為瘀血阻滯，脈絡(luò)不通，臨床以氣滯血瘀型多見，治療上多重視理氣活血，化瘀止痛[8-10]。膈下逐瘀湯出自清代王清任《醫(yī)林改錯》，主治血瘀引起的一系列病證[11]。近年來隨著對該方劑的不斷研究，發(fā)現(xiàn)其在輸卵管炎性治療方面有著顯著療效。如王忠[12]用膈下逐瘀湯治療輸卵管不通患者12例，總有效率80.0 %；趙麗燕[13]用輸卵管通液術(shù)聯(lián)合膈下逐瘀沖劑治療并與單純輸卵管通液術(shù)相比較，前者療效顯著?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，方中赤芍、牡丹皮、桃仁，烏藥、川芎、枳殼、香附，鱉甲、地龍等，具有改善末梢循環(huán)的作用，使局部血供改善，有利于黏連組織的消散與吸收。本實驗結(jié)果表明，膈下逐瘀湯加減方能抑制輸卵管上皮TNF-α蛋白的表達(dá)，強度優(yōu)于成藥康婦炎膠囊。TNF-α是炎癥反應(yīng)程度的重要指標(biāo)，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在正常輸卵管以及炎性輸卵管黏膜上皮細(xì)胞上均有表達(dá)[14]，具有抗腫瘤機制、免疫調(diào)節(jié)作用，在炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中起著重要作用，同時觀察發(fā)現(xiàn)大鼠腹腔黏連的程度越重，TNF-α的值會升高，而TNF-α產(chǎn)生減少，機體清除生殖道病原體的能力降低。如武孟香等[15]采用免疫組化法也發(fā)現(xiàn) 在正常輸卵管和炎癥輸卵管上均有TNF-α表達(dá)，但正常輸卵管黏膜上皮細(xì)胞的表達(dá)較低，炎癥輸卵管黏膜上皮細(xì)胞的表達(dá)顯著高于正常輸卵管組織。從而證明膈下逐瘀湯加減方通過對TNF-α的調(diào)節(jié)參與炎癥的愈合過程的結(jié)論，為輸卵管炎性不孕的發(fā)病機制與治療提供了理論依據(jù)。