程胖，劉博，馮瀟，魏金花，馬斌芳，李臻

（第四軍醫(yī)大學人體解剖與組織胚胎學教研室，西安，710032）

附睪作為精子成熟與貯存的場所，其特定的管腔酸性微環(huán)境對精子的成熟至關重要，而附睪上皮細胞可以通過多種酸堿轉運體調節(jié)水分、HCO3-的重吸收和質子的分泌，共同維持附睪管腔酸性微環(huán)境的平衡[1,2]。組成附睪上皮的細胞類型主要包括分布于整段附睪的主細胞、基細胞和具有區(qū)段特異性的亮細胞、狹窄細胞及少量的頂細胞等，主細胞數量約占所有附睪上皮細胞的80%，是附睪上皮中最主要的細胞類型[3]。附睪上皮細胞體外培養(yǎng)，有利于附睪上皮的功能研究深入。本實驗采用酶消化法和組織塊法對大鼠附睪上皮細胞進行了原代培養(yǎng)，然后對細胞進行了純化并和鑒定，最后檢測了相關分子如雄激素受體（androgen receptor, AR）和雌激素受體α（estrogen receptor α, ERα）在原代培養(yǎng)的附睪上皮細胞的表達情況。通過對兩種培養(yǎng)方法的觀察、比較，我們篩選出了更適合、有效的培養(yǎng)方法，從而為體外研究附睪上皮細胞的功能奠定了基礎。

材料與方法

1 實驗動物

健康雄性SD大鼠，4～5周齡，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。

2 主要試劑

MEM培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司），5α-DHT、丙酮酸鈉（sigma公司），無Ca2+、Mg2+的PBS，胰蛋白酶（Gibco公司），I型膠原酶（Gibco公司），兔抗Clusterin多克隆抗體（Novus公司），兔抗AR多克隆抗體（Santa Cruz公司）和兔抗ERα多克隆抗體（Abcam公司），Alexa488標記羊抗兔IgG（Invitrogen公司），生物素標記的羊抗兔IgG（中杉金橋）。

3 大鼠附睪的采集

用2%戊巴比妥鈉麻醉4～5周齡的SD大鼠，消毒腹部，打開腹腔，無菌條件下取雙側附睪組織，置于無Ca2+、Mg2+的含青-鏈霉素雙抗的PBS中,充分漂洗。

4 附睪上皮細胞的原代培養(yǎng)

將沖洗好的附睪組織置于平皿中，用眼科剪和眼科鑷盡量分離干凈周圍的脂肪組織和結締組織，然后剪碎成糜狀，分兩部分分別用于酶消化法培養(yǎng)和組織塊法培養(yǎng)。

酶消化法：將剪碎的組織置于15ml離心管中，先加入0.25%胰蛋白酶消化10min，1000g 離心5min，去除上清，再加入0.25%I型膠原酶消化15～20min，待組織成糜狀后，1000g 離心5min，去上清。用含1mmol/L丙酮酸鈉、1nmol/L 5α-DHT、100 IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素及10% FBS的MEM培養(yǎng)基重懸細胞，接種于60mm培養(yǎng)皿中。置于32℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6h后將未貼壁的上皮細胞轉移至新的60mm培養(yǎng)皿繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，棄掉6h前貼壁的細胞[4,5]。次日換液，2d左右細胞即可形成單層進行傳代。

組織塊培養(yǎng)法：將1mm3大小的組織塊以0.5cm的間距貼于培養(yǎng)皿中，每個組織塊上滴加一滴培養(yǎng)液濕潤組織，放置好后，輕輕翻轉培養(yǎng)皿，使皿底朝上，置32℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱4～5h，使組織塊略微干涸。然后輕輕加入適量（約2mm高）培養(yǎng)液，靜置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h，培養(yǎng)基變黃時換液。培養(yǎng)至2～3d時即有成纖維細胞遷出，3～5d左右上皮細胞逐漸遷出。待細胞形成單層后即可傳代。

5 細胞的傳代及純化

酶消化法的細胞純化：酶消化法的細胞在接種后，已根據細胞貼壁時間的差異進行了初步純化。待細胞長滿形成單層時，進一步利用兩步消化法純化附睪上皮細胞。首先吸除培養(yǎng)液，用無Ca2+、Mg2+的PBS漂洗以除去殘余培養(yǎng)基，然后加入1ml 0.25%的胰蛋白酶消化1～2min，輕彈皿底，使先被消化下來的成纖維細胞游浮于消化液中，吸棄消化液；再向皿中加入1ml 0.25%胰蛋白酶繼續(xù)消化，3～5min后加入1ml含血清的MEM培養(yǎng)基終止消化。將消化液移入無菌離心管中，1000g離心5min，棄上清，細胞培養(yǎng)液重懸細胞，接種于60mm的培養(yǎng)皿中或24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)。

組織塊法的細胞純化：培養(yǎng)約一周時，組織塊周圍遷移出的細胞基本鋪滿皿底，可進行傳代培養(yǎng)。此時，成纖維細胞和附睪上皮細胞混雜生長。用兩步消化法純化附睪上皮細胞，方法同上。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細胞鋪滿或呈80%～90%匯合度時，繼續(xù)傳代純化。

6 附睪上皮細胞的鑒定

經傳代、純化后得到的細胞大多成圓形或多角形，匯合后形成鋪路石樣形狀。利用細胞免疫熒光染色技術對所得細胞進行鑒定，待24孔板中的細胞長至50%～60%時（不要過密以免細胞重疊），用PBS輕柔洗3遍以去除漂浮的死細胞，然后在24孔內加入1ml 4%的多聚甲醛進行細胞固定。30min后，吸棄固定液，室溫自然晾干后用PBS清洗3遍；然后用山羊血清封閉30min，再依次加入兔抗Clusterin多克隆抗體（1∶100）室溫孵育2h，Alexa488標記山羊抗兔 IgG（1∶400）室溫孵育 1h，DAPI（1∶100）孵育15min，PBS清洗后用倒置顯微鏡觀察、照相。

7 附睪上皮細胞中相關蛋白的表達檢測

由于附睪功能的發(fā)揮依賴于雄激素及雌激素，而該兩種激素功能的發(fā)揮依賴于與其受體結合[6,7]。因此，我們進一步利用免疫組織化學染色技術分別檢測了雄激素受體（AR）和雌激素受體α（ERα）在原代培養(yǎng)的附睪上皮細胞中的表達情況。4%多聚甲醛溶液固定細胞、山羊血清封閉后，分別加入兔抗AR（1∶300）和兔抗 ERα（1∶100）室溫孵育 2h；然后分別加入生物素標記的抗兔IgG（1∶500）進行二抗孵育2h；滴加適量ABC復合物，室溫孵育1h；DAB顯色，顯微鏡下觀察到棕黃色的陽性信號后立即放入蒸餾水中終止反應。

結 果

1 酶消化法獲得的附睪上皮細胞

酶消化法6h后貼壁的細胞大多數是附睪上皮細胞，呈圓形、多角形或不規(guī)則形，其中混雜有少量梭形的成纖維細胞。2～3d后，細胞即可達到80%的匯合度。消化過程中殘留有少許未充分消化的組織小團塊，這些小團塊周圍更容易長出成團的附睪上皮細胞（圖1）。

圖1 酶消化法原代培養(yǎng)的大鼠附睪上皮細胞。比例尺，20μmFig. 1 Primary rat epididymal epithelial cells isolated through enzyme digestion. Scale bar, 20μm

2 組織塊培養(yǎng)法獲得的附睪上皮細胞

組織塊原代培養(yǎng)約7d時，遷移出的細胞基本鋪滿皿底，但是雜細胞較多，尤其是成纖維細胞生長優(yōu)勢明顯，但可根據細胞匯集方式和形態(tài)的不同進行區(qū)分。其中，附睪上皮細胞常成團生長，而成纖維細胞常呈索條狀生長，兩種細胞之間有明顯的生長界限（圖2）。

圖2 組織塊法原代培養(yǎng)的大鼠附睪上皮細胞。比例尺，20μmFig. 2 Primary rat epididymal epithelial cells isolated through tissue explant. Scale bar, 20μm

圖3 培養(yǎng)大鼠附睪上皮細胞的Clusterin免疫熒光染色鑒定。A，相差顯微鏡像；B，clusterin免疫熒光染色像；比例尺，20μmFig. 3 Clusterin staining to identify rat epididymal epithelial cells in culture. A, phase contrast; B, immunostaining of clusterin (green); scale bar, 20μm

3 附睪上皮細胞的純化及鑒定

根據附睪上皮細胞與成纖維細胞對胰酶敏感性的差異，利用兩步消化法對原代培養(yǎng)的附睪上皮細胞進行純化。胰酶消化1～2min時即可看到成纖維細胞逐漸變圓從皿底脫落，此時上皮細胞尚未脫離皿底，故棄除第一步的消化液即可除去大部分的成纖維細胞。再次消化、離心后最終得到的細胞主要為附睪上皮細胞。組織塊法培養(yǎng)的附睪上皮細胞純化效果較差，仍殘留許多占優(yōu)勢生長的成纖維細胞。酶消化法中的成纖維細胞數量相對較少，純化效果較好（圖3 A）。

利用細胞免疫熒光染色對培養(yǎng)的上皮細胞進行鑒定，結果顯示幾乎所有的細胞的胞質部分均呈附睪主細胞的標記物Clusterin[8,9]陽性，由此可知培養(yǎng)得到的上皮細胞中主要是主細胞（圖3 B）。

4 AR和ERα在原代培養(yǎng)的附睪上皮中的表達

免疫組織化學染色顯示培養(yǎng)得到的大鼠附睪上皮細胞中有AR（圖4 A）和ERα（圖4 B）的表達，二者均定位于細胞核內。

討 論

附睪是精子成熟、獲得受精能力、儲存和保護精子的重要器官[10]。附睪上皮細胞的緊密連接參與形成血-附睪屏障，可以保護成熟中的精子不受外界干擾，并將精子與自身免疫系統(tǒng)隔離[11]。另外，附睪上皮細胞也可通過多種酸堿轉運體調節(jié)水分和HC的重吸收以及質子的分泌，使附睪形成了一個特異的管腔微環(huán)境，從而有利于精子的成熟和靜息狀態(tài)的維持[2,12]。除此之外，附睪上皮細胞尤其是主細胞，可以分泌大量蛋白進入附睪管腔，對精子成熟和受精能力的獲得也是至關重要的[11,13,14]。主細胞是附睪上皮中數量最多的一種細胞類型，在原代及培養(yǎng)傳代過程中會逐漸形成生長優(yōu)勢，因此可用主細胞的標記物檢測原代培養(yǎng)的細胞是否為附睪上皮細胞。附睪上皮細胞的體外培養(yǎng)模式的建立，也將促進對附睪體內生化過程的了解，最終促進附睪功能研究的進展。

圖4 大鼠附睪上皮細胞核中AR（A）和ERα（B）的免疫細胞化學定位。比例尺，20μmFig. 4 The AR (A) and ERα (B) localizations in the nuclei of rat epididymal epithelial cells were indicated by immunohistochemistry. Scale bar, 20μm

本實驗選取4～5周齡的未成熟大鼠進行附睪上皮細胞的原代培養(yǎng)，可以避免精子對附睪上皮細胞貼壁的阻礙作用[5]。另外，我們采用酶消化法和組織塊培養(yǎng)法對大鼠附睪上皮細胞進行原代培養(yǎng)并對兩種培養(yǎng)方法進行比較。酶消化法采取胰酶和膠原酶分步消化的方法，消化時間與組織塊剪碎的程度等密切相關，消化過度易導致細胞貼壁率低，應實時觀察消化狀態(tài)對消化時間進行調整。在酶消化法過程中，我們又利用成纖維細胞比上皮細胞貼壁快這一特點，采用差速貼壁的方法使二者分離，從而減少上皮細胞中的雜細胞。在細胞傳代時，進一步根據成纖維細胞與上皮細胞對胰酶敏感性的差異再次純化細胞，從而得到純度較高的附睪上皮細胞。采用組織塊法培養(yǎng)時，要嚴格掌握培養(yǎng)液用量，過多易導致植塊漂浮，過少則使植塊干涸。本實驗采取先在植塊上滴加一滴培養(yǎng)液略微覆蓋植塊，待植塊周圍的培養(yǎng)液微干涸之前，補加適量的培養(yǎng)液，可顯著降低植塊漂浮率。與酶消化法相比，組織塊法能夠減少胰酶對細胞貼壁的影響，但上皮細胞遷出緩慢，一般3～5d后才開始有細胞遷出，形成單層細胞則至少需要1周左右，且混合有大量的成纖維細胞，不利于后期上皮細胞的純化。綜合比較兩種原代培養(yǎng)方法，建議采用差速貼壁的酶消化法進行培養(yǎng)。

AR和ERα在原代培養(yǎng)的大鼠附睪上皮細胞中均有表達，提示該細胞具有對雄激素和雌激素反應的能力，故原代培養(yǎng)的附睪上皮細胞將為體外研究這兩種激素在雄性生殖系統(tǒng)的功能提供有利幫助。目前，一些附睪上皮細胞系雖已成功建立，但這些細胞系也存在一定的缺陷，例如已得到的大鼠附睪頭部細胞系RCE中，由于AR表達水平較低導致該細胞對雄激素的敏感性降低[15]。雖然原代培養(yǎng)的細胞不具備細胞系可以大量增殖的特點，但因與體內環(huán)境更為接近，可以更有效地研究附睪的功能，且已有報道證明適宜濃度的海藻糖可以增加小鼠附睪上皮細胞的增殖潛力[16]，在后續(xù)的研究中我們亦可添加不同濃度的海藻糖，探索適合大鼠附睪上皮細胞生長的最佳反應體系。

綜上所述，我們比較了大鼠附睪上皮細胞的兩種原代培養(yǎng)方法，即組織塊培養(yǎng)和酶消化法培養(yǎng)，發(fā)現酶消化法結合差速貼壁法和傳代培養(yǎng)時的兩步消化法能夠較快地得到純度高的附睪上皮細胞。雖然我們成功建立了附睪上皮細胞原代培養(yǎng)體系，但其培養(yǎng)體系仍有待繼續(xù)優(yōu)化，以延長其存活時間和增殖代數，從而為更好地進行附睪功能的體外研究奠定基礎。