劉玉璞，國海東，邵水金

（上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖教研室，上海201203）

施萬細(xì)胞（Schwann cell，SC）是一種存在于周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，參與形成髓鞘，并對(duì)周圍神經(jīng)起到保護(hù)、促進(jìn)軸突再生及再生軸突的髓鞘化等作用[1]。SC分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)生長因子，參與周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)，因此被廣泛研究[2]。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞以研究導(dǎo)入基因功能和機(jī)制的方法[2,3]。目前轉(zhuǎn)染細(xì)胞常用方法主要為非病毒載體法和病毒載體法，前者操作簡單，廣為應(yīng)用；后者則有安全性欠佳和步驟繁瑣等缺點(diǎn)[4]。非病毒載體法所使用的轉(zhuǎn)染試劑主要是脂質(zhì)體，其中常用的脂質(zhì)體Lipofectamine 2000對(duì)許多細(xì)胞都具有較好的轉(zhuǎn)染效率[5,6]。

轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率可能存在差異，如Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染庫普弗細(xì)胞則效率欠佳[7]。SC的轉(zhuǎn)染效率較低，鮮見能夠高效轉(zhuǎn)染SC的轉(zhuǎn)染試劑，這給科研人員造成了較大的障礙[8]。因此，本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)大鼠SC株（RSC96），利用幾種常見的廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染綠色熒光標(biāo)記物FAM，比較以找到效率最高的轉(zhuǎn)染試劑，并對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞毒性的觀察，以尋找到最理想的轉(zhuǎn)染試劑。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

大鼠RSC96購自上海中科院細(xì)胞研究所，lipofectamine 2000購自invitrogen公司，F(xiàn)uGENE6 Transfection Reagent購自Promega公司，SuperFectin II reagent購自上海普飛生物技術(shù)有限公司，羧基熒光素（FAM）標(biāo)記的microRNA（miRNA）陰性對(duì)照由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和PBS均購自美國CORNINIG公司，CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，TUNEL凋亡試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司。

2 大鼠SC株RSC96的培養(yǎng)

大鼠RSC96是一種貼壁生長的細(xì)胞，所用培養(yǎng)液成分為含4.5g/L葡萄糖的DMEM（含10% FBS），置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，2～3d傳代1次。

3 三種轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記的miRNA

3.1 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染

細(xì)胞按每孔100μl傳代至96孔板，至少設(shè)5個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底的60%～70%行轉(zhuǎn)染。換為不含血清的DMEM后分別將羧基熒光素（FAM）標(biāo)記的miRNA陰性對(duì)照用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染RSC96，用法用量嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000產(chǎn)品說明書，設(shè)置3個(gè)時(shí)間點(diǎn)：①轉(zhuǎn)染24h后PBS清洗，換為正常培養(yǎng)液后于熒光顯微鏡下觀察拍照，并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，簡稱24h組；②轉(zhuǎn)染48h后如上所述，拍照計(jì)數(shù)，簡稱48h組；③轉(zhuǎn)染8h后清洗換液，48h后拍照計(jì)數(shù)，簡稱8h-48h組。

3.2 FuGENE 6 Transfection Reagent轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染試劑改為FuGENE6 Transfection Reagent，其他操作同上。

3.3 SuperFectin II reagent轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染試劑改為SuperFectinII Reagent，其他操作同上。

3.4 正常對(duì)照

將細(xì)胞正常傳代到96孔板，不做轉(zhuǎn)染，其他操作同上。

4 轉(zhuǎn)染效率計(jì)算

按1∶100比例拍攝，用ImageJ對(duì)綠色熒光轉(zhuǎn)染成功數(shù)和同視野下所有細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。3組各統(tǒng)計(jì)10個(gè)視野。該轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率（%）=綠色熒光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

5 CCK-8法檢測細(xì)胞活性

96孔板每孔加入10μl的CCK8試劑，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置2h后讀取450nm波長處OD值（吸光度）。OD值越高表示細(xì)胞活性越高。

6 TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡

96孔板每孔PBS清洗后4%多聚甲醛固定15min，按照TUNEL試劑盒說明加入適量TUNEL反應(yīng)液后于37℃反應(yīng)1h。PBS清洗，DAPI襯染細(xì)胞核，磷酸甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，拍照統(tǒng)計(jì)各組凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22軟件處理數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SuperFectin II reagent轉(zhuǎn)染效率高

應(yīng)用FuGENE6 Transfection Reagent轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中未見任何被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，與對(duì)照組相同，轉(zhuǎn)染效率為0%；在用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中可見較多的被轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)染效率分別為（38±8）%、（40±5）% 和（15±5）%，均低于60%；在用SuperFectin II Reagent轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，可見更多被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（圖1），其在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)染效率分別為（88±7）%、（90±6）%和（70±10）%，明顯高于Lipofectamine 2000（P＜0.01）。由此表明，F(xiàn)uGENE6 Transfection Reagent不適于RSC96的miRNA轉(zhuǎn)染；Lipofectamine 2000雖有一定的轉(zhuǎn)染率，但不足以滿足實(shí)驗(yàn)需求；只有SuperFectin II Reagent的轉(zhuǎn)染效率能滿足實(shí)驗(yàn)需求。此外，Lipofectamine 2000和SuperFectin II Reagent在8h-48h組的轉(zhuǎn)染效率明顯低于48h組，但SuperFectin II Reagent轉(zhuǎn)染效率仍達(dá)到平均70%（圖1），表明其在轉(zhuǎn)染8h后換液其轉(zhuǎn)染效率仍能基本滿足實(shí)驗(yàn)需求。

2 三種轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞活力的影響

CCK-8檢測細(xì)胞活性表明，在3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，與Control組比較，F(xiàn)uGENE6 Transfection Reagent對(duì)細(xì)胞活力的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Lipofectamine 2000和SuperFectin II Reagent則不同程度地降低細(xì)胞活力；與Lipofectamine 2000組比較，SuperFectin II Reagent組細(xì)胞活力更低，表明SuperFectin II Reagent細(xì)胞毒性更大（圖2）。此外，與48h細(xì)胞活力對(duì)比，8h-48h時(shí)Lipofectamine 2000和SuperFectin II Reagent組的細(xì)胞活力升高，表明轉(zhuǎn)染8h后換液能夠降低這兩種轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞毒性。

圖1 三種轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記的miRNA（綠色熒光）效率對(duì)比。FuGENE 6，F(xiàn)uGENE 6 Transfection Reagen；Lipofectamin，Lipofectamin 2000；SuperFectin，SuperFectin II Reagent；比例尺，100μmFig. 1 Comparison of the transfection efficiency of FAM-labeled miRNAs (green) with three transfection reagents. FuGENE 6∶ FuGENE 6 Transfection Reagen; Lipofectamin∶ Lipofectamin 2000; SuperFectin∶ SuperFectin II Reagent; scale bar, 100μm

圖2 CCK-8法檢測3種轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞活力影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。**，P＜0.01，與Control組比較；##，P＜0.01，與Lipofectamin組比較Fig. 2 Statistical analysis of the effects of three transfection reagents on the cell viability by CCK-8 assay. **, P＜0.01, compared with control group; ##, P＜0.01, compared with Lipofectamin group

3 三種轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL凋亡染色檢測顯示，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與Control組比較，F(xiàn)uGENE6 Transfection Reagent對(duì)細(xì)胞凋亡無明顯影響；24h時(shí)，Lipofectamine 2000對(duì)細(xì)胞凋亡也無明顯影響，48h和8h-48h時(shí)的Lipofectamine 2000能明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡， SuperFectin II reagent在3個(gè)時(shí)間均促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并明顯強(qiáng)于Lipofectamine 2000（圖3、4）。此外與48h時(shí)間點(diǎn)對(duì)比，8h-48h時(shí)SuperFectin II reagent組細(xì)胞凋亡減少，提示轉(zhuǎn)染8h后換液能夠降低SuperFectin II reagent的促細(xì)胞凋亡作用。

圖4 TUNEL染色檢測3種轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞凋亡影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。*，0.01＜P＜0.05，與 Control組比較；**，P＜0.01，與 Control組比較；##，P＜0.01，與Lipofectamin組比較Fig.4 Statistical analysis of the effects of three transfection reagents on apoptosis by TUNEL staining. *, 0.01＜P＜0.05 compared with control group; **, P＜0.01, compared with control group; ##, P＜0.01, compared with Lipofectamin group

討 論

SC是周圍神經(jīng)系統(tǒng)中主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其參與神經(jīng)的生長、損傷后修復(fù)，因此其作為周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復(fù)的關(guān)鍵被廣泛研究[9]，糖尿病患者周圍神經(jīng)病變，SC凋亡和脫髓鞘的機(jī)制研究已成熱點(diǎn)[10]。細(xì)胞轉(zhuǎn)染是醫(yī)學(xué)科研工作中最常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一，SC屬于難以轉(zhuǎn)染的貼壁細(xì)胞，找到一種轉(zhuǎn)染SC效率較高的轉(zhuǎn)染試劑具有較高的科研價(jià)值[11]。

圖3 TUNEL染色檢測轉(zhuǎn)3種染試劑對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。比例尺，100μmFig.3 Effects of three transfection reagents on cell apoptosis detected by TUNEL staining. Scale bar, 100μm

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)，使用3種不同的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染綠色熒光素FAM標(biāo)記的miRNA陰性對(duì)照，從細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率角度評(píng)價(jià)其轉(zhuǎn)染效果。數(shù)據(jù)分析表明，SuperFectin II Reagent的轉(zhuǎn)染效率最高，能夠滿足SC轉(zhuǎn)染后研究的需要；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染效率低；FuGENE6 Transfection Reagent可能不適用于轉(zhuǎn)染miRNA進(jìn)入SC。因此，不同轉(zhuǎn)染試劑對(duì)于SC的轉(zhuǎn)染效率存在著較大差異；在正式轉(zhuǎn)染有關(guān)產(chǎn)品之前，最好先做下熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)染以確定轉(zhuǎn)染是否成功。

轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞毒性不容忽視，毒性過大則直接影響到細(xì)胞的存活和增殖、遷移、凋亡方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)CCK-8和TUNEL染色結(jié)果，F(xiàn)uGENE6 Transfection Reagent基本無細(xì)胞毒性，Lipofectamine 2000具有一定毒性，SuperFectin II reagent毒性更大，而經(jīng)換液后則有一定程度的改善，結(jié)合第一部分轉(zhuǎn)染效率的結(jié)果，建議使用SuperFectin II reagent對(duì)RSC96進(jìn)行miRNA轉(zhuǎn)染，并在8h進(jìn)行換液以降低其細(xì)胞毒性。

值得提出的是，miRNA的激動(dòng)劑和拮抗劑經(jīng)過特殊化學(xué)修飾后成為miRNAagomir和antagomir，其在動(dòng)物體內(nèi)外具有更高的穩(wěn)定性和效果持續(xù)時(shí)間，且能克服體內(nèi)細(xì)胞膜、組織等障礙富集于靶細(xì)胞。在后續(xù)試驗(yàn)中我們嘗試以Cy3（紅色熒光）標(biāo)記的miRNAagomir陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染RSC96，結(jié)果也較為理想。因此，直接使用miRNAagomir和antagomir也不失為一種提高轉(zhuǎn)染效率的方法。

Lipofectamine 2000是應(yīng)用廣泛的轉(zhuǎn)染試劑，屬于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，有轉(zhuǎn)染需要更換無血清培養(yǎng)液、本身參與細(xì)胞生理活動(dòng)造成一定細(xì)胞毒性的缺點(diǎn)[12]。有鑒于此，較多的非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑被大力研究開發(fā)，F(xiàn)uGENE 6 Transfection Reagent就是其中之一，其具有較低的細(xì)胞毒性，轉(zhuǎn)染效率與Lipofectamine 2000相當(dāng)[13]，且無需更換培養(yǎng)液，簡化操作步驟。SuperFectin II Reagent是第三代陽離子聚合物型轉(zhuǎn)染試劑，目前尚在不斷開發(fā)，其具有更廣的細(xì)胞適用范圍和更快的轉(zhuǎn)染速度；但從本文結(jié)果看尚需注意控制其細(xì)胞毒性?？傊緦?shí)驗(yàn)為大鼠SC的基因領(lǐng)域研究打下基礎(chǔ)，為更方便、高效的探究RSC96細(xì)胞相關(guān)基因修飾后的功能和機(jī)制提供便利。