張騫，韓艷春，曹璋，于洋，張艷智，馬莉，趙塞

（1濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，濱州 256603；2濱州醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，煙臺 264003）

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和致死率仍然高居不下，尤其是發(fā)病率還在不斷增加。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)腸癌患者死亡的主要因素。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是結(jié)腸癌浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機(jī)制之一。因此研究結(jié)腸癌EMT發(fā)生的分子機(jī)制，對于改善預(yù)后，提高患者的生存率至關(guān)重要。Livin是凋亡抑制蛋白家族的重要成員，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Li等[1]報道livin在乳腺癌組織中表達(dá)升高并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。而livin與結(jié)腸癌組織EMT表型的關(guān)系目前尚未見報道。為此，我們研究了結(jié)腸癌組織中l(wèi)ivin和EMT表型的表達(dá)情況及其臨床意義，并探討了livin和EMT之間的關(guān)系。

材料與方法

1 臨床資料

70例結(jié)腸癌組織標(biāo)本取自濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科存檔的蠟塊。所有患者均經(jīng)手術(shù)切除治療，術(shù)前未接受放療或化療等治療。其中男性結(jié)腸癌患者 38例，女性結(jié)腸癌患者32例。腫塊直徑≥5cm者42例，腫塊直徑＜5cm者28例。腫瘤浸潤至肌層者29例，腫瘤浸潤達(dá)漿膜者41例。依據(jù)WHO分級和分期標(biāo)準(zhǔn)：高中分化程度者34例，低和未分化程度者36例；I+Ⅱ期者31例，Ⅲ+Ⅳ期者39例。未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者30例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者40例。用于Western blot檢測的8例新鮮結(jié)腸癌組織標(biāo)本收集后即刻置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2 試劑

兔抗人livin、E-cadherin抗體購于武漢博士德生物工程有限公司；兔抗人vimentin、N-cadherin抗體購于北京博奧森生物科技有限公司；鼠抗人單克隆GAPDH抗體、增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗兔IgG、免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯示試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購于北京中杉金橋生物公司；ECL發(fā)光試劑購于Thermo公司。

3 免疫組織化學(xué)

收集來的結(jié)腸癌組織蠟塊標(biāo)本均制成4μm厚的組織切片，置于枸櫞酸鹽緩沖液中煮沸進(jìn)行抗原修復(fù)，Envision法免疫組織化學(xué)染色。一抗用PBS緩沖液來代替作為陰性對照，而已知陽性的結(jié)腸癌組織切片則用來作為陽性對照。第一抗體livin（1∶100）、E-cadherin （1∶ 300）、vimentin（1∶ 300）和N-cadherin（1∶ 300）4℃孵育過夜。次日滴加增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。結(jié)果判定：livin主要于細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，按著色細(xì)胞數(shù)量的比例劃分為5個等級：無著色為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；依據(jù)染色強(qiáng)度又劃分為4個等級：無染色者為0分，染為淡黃色者為1分，染為黃色或棕黃色者為2分，染為棕褐色者為3分。最后的IHC總分=著色細(xì)胞比例得分×染色強(qiáng)度得分，得分≥2定為livin表達(dá)陽性。E-cadherin主要表達(dá)于細(xì)胞膜，＞50%的細(xì)胞呈現(xiàn)出棕黃色顆粒記為表達(dá)陽性；N-cadherin表達(dá)于細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，＞10%的細(xì)胞呈現(xiàn)出棕黃色顆粒記為表達(dá)陽性；vimentin主要在間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，若在結(jié)腸腺上皮細(xì)胞中＞10%的細(xì)胞有著色記為表達(dá)陽性。

4 Western blot分析

以RIPA裂解液加入到新鮮的結(jié)腸癌組織中處理組織樣本，提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定。以60μg總蛋白加入到電泳上樣孔道中，于10% SDS-PAGE中電泳，將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，加入兔抗livin、E-cadherin、vimentin、N-cadherin抗 體（ 均1∶500）4℃冰箱中過夜。次日，分別以相應(yīng)羊抗兔IgG（1∶ 1500）室溫孵育2h，用ECL顯影后凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Image system UVP公司）拍照。結(jié)果用Image J軟件進(jìn)行條帶光密度值測定，以與內(nèi)參GAPDH（1∶1500，北京中杉金橋生物公司）的比值作為各指標(biāo)的相對表達(dá)量。

5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，采用χ2檢驗分析livin與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系，用Pearson相關(guān)檢驗對livin表達(dá)與EMT標(biāo)志蛋白的免疫組化結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，采用t檢驗分析統(tǒng)計組間的差異，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Livin在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測70例結(jié)腸癌組織和相應(yīng)癌旁正常結(jié)腸黏膜組織中l(wèi)ivin免疫反應(yīng)性顯示，結(jié)腸癌組織中l(wèi)ivin主要于結(jié)腸癌癌細(xì)胞核內(nèi)呈陽性表達(dá)（圖1）。結(jié)腸癌組織中l(wèi)ivin的表達(dá)陽性率61.4%（43/70），顯著高于相應(yīng)癌旁正常結(jié)腸黏膜組織中l(wèi)ivin的表達(dá)陽性率8.6%（6/70）。

2 Livin與結(jié)腸癌患者的臨床病理特征的關(guān)系

對免疫組織化學(xué)檢測的livin表達(dá)與70例結(jié)腸癌患者的臨床病理特征進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析顯示，TNMⅢ+Ⅳ分期的結(jié)腸癌患者組織中l(wèi)ivin陽性表達(dá)率明顯高于TNMI+Ⅱ分期的患者；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者組織中l(wèi)ivin陽性表達(dá)率明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；而Livin陽性表達(dá)與結(jié)腸癌患者的年齡、性別、腫瘤的大小、腫瘤的組織學(xué)分級和TNM分期差異沒有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

圖1 Livin在結(jié)腸癌及癌旁組織中表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測。A，在結(jié)腸癌中呈陽性；B，在癌旁組織中呈陰性；比例尺，50μmFig.1 Immunohistochemical examination on the expression of livin in colorectal cancer and adjacent normal tissues. A, livin was strongly positive in colorectal cancer tissues; B, livin was negative in adjacent normal colorectal tissues; scale bar, 50μm

表1 Livin表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系Tab. 1 Correlation between livin expression and clinicopathological features of patients with colorectal cancer

3 結(jié)腸癌組織中Livin與E-cadherin、vimentin、N-cadherin表達(dá)之間的關(guān)系

免疫組織化學(xué)檢測的70例結(jié)腸癌組織中E-cadherin、vimentin、N-cadherin的表達(dá)情況為：E-cadherin主要定位于結(jié)腸癌癌細(xì)胞膜，35.7%（25/70）呈陽性表達(dá)；vimentin主要定位于結(jié)腸癌癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，32.9%（23/70）呈陽性表達(dá)；N-cadherin主要定位于結(jié)腸癌癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，60%（42/70）呈陽性表達(dá)（圖2）。對livin與E-cadherin、vimentin、N-cadherin的表達(dá)應(yīng)用Pearson相關(guān)檢驗進(jìn)行相關(guān)性分析表明：livin與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與vimentin和N-cadherin表達(dá)呈正相關(guān)（表2）。Western blot檢測顯示，livin高表達(dá)的結(jié)腸癌組織中，E-cadherin呈低表達(dá)，vimentin和N-cadherin呈高表達(dá)（圖3）。

表2 Livin與結(jié)腸癌EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)的關(guān)系Tab. 2 Correlation between livin and EMT marker proteins in colorectal cancer

圖2 E-cadherin、vimentin和N-cadherin在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)。A，E-cadherin 胞膜（-）；B，vimentin 胞質(zhì)（+）；C，N-cadherin 胞質(zhì)（+）；比例尺，50μmFig. 2 Expression of E-cadherin, vimentin and N-cadherin in colorectal cancer tissues. A, negative E-cadherin in plasma membrane (-); B, positive vimentin in cytoplasm (+); C, positive N-cadherin in cytoplasm (+); scale bar, 50μm

圖3 Livin、E-cadherin、vimentin、N-cadherin在結(jié)腸癌組織中表達(dá)的Western blot檢測。L，livin低表達(dá)的結(jié)腸癌組織；H，livin高表達(dá)的結(jié)腸癌組織Fig. 3 Western blot analysis of livin, E-cadherin, vimentin and N-cadher expressions in colorectal cancer tissues. L, colorectal cancer tissue with low expression of livin; H, colorectal cancer tissue with high expression of livin

討 論

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化時，細(xì)胞形態(tài)由上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，上皮性腫瘤細(xì)胞的上皮標(biāo)志物如上皮鈣黏蛋白（E-cadherin），細(xì)胞角蛋白（cytokeratin）等減少，細(xì)胞骨架蛋白等間質(zhì)標(biāo)志物如波形蛋白（vimentim)、神經(jīng)鈣黏蛋白（N-cadherin）、纖連蛋白（fibronectin）等增加，因此，可以通過檢測這些標(biāo)志物來鑒定EMT的發(fā)生[2-4]。EMT是上皮源性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦咔忠u性表型的關(guān)鍵步驟，同時也是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要前提條件之一。EMT發(fā)生使得結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，但目前結(jié)腸癌EMT發(fā)生的機(jī)制尚未闡明。

Livin又稱為ML-IAP或KIAP，是凋亡抑制蛋白（IAPs）家族成員。IAP家族在細(xì)胞生長，腫瘤進(jìn)展等方面發(fā)揮了重要作用，一些凋亡抑制因子已經(jīng)進(jìn)入臨床實驗階段[5-7]。以往研究發(fā)現(xiàn)，livin與肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種人類惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)[8-11]。Wang等[12]研究表明，livin在結(jié)直腸癌中表達(dá)增強(qiáng)，并與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)。然而，livin與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。我們實驗結(jié)果表明，livin在TNM分期高的結(jié)腸癌中的表達(dá)高于在TNM分期低的結(jié)腸癌中的表達(dá)，而且發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者組織中l(wèi)ivin蛋白表達(dá)水平高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示Livin表達(dá)增強(qiáng)可能對結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移進(jìn)展有重要的促進(jìn)作用，這可為結(jié)腸癌的治療提供一個新的研究基礎(chǔ)。

有報道livin在乳腺癌中呈高表達(dá)，并可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT發(fā)生，從而促進(jìn)乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移[1]。我們的實驗結(jié)果表明，livin與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與N-cadherin和vimentin表達(dá)呈正相關(guān)；并且通過Western blot檢測也發(fā)現(xiàn)livin高表達(dá)的結(jié)腸癌組織中，E-cadherin呈低表達(dá)，vimentin和N-cadherin呈高表達(dá)。以上結(jié)果提示livin與結(jié)腸癌的EMT表型有關(guān)，livin可能通過下調(diào)E-cadherin，上調(diào)vimentin和N-cadherin介導(dǎo)EMT發(fā)生，從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。如果能夠抑制livin，有可能阻止腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫離和侵襲轉(zhuǎn)移。但結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移是個復(fù)雜的過程，本實驗研究僅從組織水平初步驗證livin和EMT表型有關(guān)，livin是通過什么途徑調(diào)控EMT表型的改變需要進(jìn)一步深入的研究。