尋崇榮，王冬梅，吳長玲，王中江，江連洲，李 楊，范志軍

(1黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責任公司，哈爾濱 150036；2東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，哈爾濱 150030)

嬰兒配方奶粉是為滿足不同市場需求而在生產(chǎn)加工過程中向牛奶中添加各種營養(yǎng)成分，以滿足不同年齡組營養(yǎng)需求的調(diào)配奶制品[1]。配方奶粉在室溫下于密封袋或密封罐等厭氧環(huán)境中儲存，其保質(zhì)期通常為12～24個月[2]。研究表明，奶粉品質(zhì)在儲藏期間劣化的原因非常復雜，可能是物理反應(yīng)，也可能是脂質(zhì)氧化和美拉德反應(yīng)等化學反應(yīng)引起的風味劣變，或者是影響配方奶粉品質(zhì)的各種因素相互影響，導致配方奶粉品質(zhì)劣變[3-4]。產(chǎn)品風味是導致消費者接受程度的重要指標，配方奶粉在儲藏期間會產(chǎn)生不同程度的異味，這些異味成分存在潛在毒性，以減少配方粉營養(yǎng)價值，異味來源可能是由脂肪氧化、蛋白氧化及美拉德反應(yīng)等產(chǎn)生醛類物質(zhì)引起[5]。

豆粉中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)及大豆低聚糖、大豆異黃酮、大豆卵磷脂等功能性成分，成為兒童營養(yǎng)配方粉的主要原料[6]，故而優(yōu)先考慮原料豆粉的儲藏期品質(zhì)失穩(wěn)對配方粉風味劣變影響規(guī)律。豆粉中不飽和脂肪酸的氧化產(chǎn)物主要是氫過氧化物—高活性分子，其生成后迅速分解，產(chǎn)生揮發(fā)性及非揮發(fā)性化合物組成的復雜混合物，如烴類、醛類和酮類物質(zhì)，會影響產(chǎn)品的整體質(zhì)量，另外，這些氧化產(chǎn)物可能與蛋白結(jié)合，產(chǎn)生異味成分[4，7]。其中醛類在風味改變和毒理學方面尤為重要[7]。在豆粉制取工藝中的預(yù)處理環(huán)節(jié)中，隨著大豆細胞結(jié)構(gòu)被破壞，多不飽和脂肪酸很容易在脂肪氧合酶的催化下發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生自由基和活性次生氧化產(chǎn)物，可能會誘導大豆蛋白氧化。蛋白質(zhì)氧化是蛋白質(zhì)分子在ROS直接作用下，或通過次生氧化產(chǎn)物間接作用于蛋白質(zhì)而導致的蛋白質(zhì)共價結(jié)構(gòu)修飾。蛋白質(zhì)氧化是影響食品質(zhì)量的重要因素，是導致蛋白質(zhì)營養(yǎng)損失、風味惡化以及功能性質(zhì)下降的重要原因。鑒于此，本項目分析了蛋白質(zhì)氧化值變化規(guī)律，具體蛋白質(zhì)氧化值依據(jù)羰基含量的測定方法，原理是蛋白在儲藏期間與氧氣、油脂及金屬離子相互作用而形成羰基，主要是N末端連接的α-氨基、賴氨酸、精氨酸、半胱氨酸及脯氨酸側(cè)鏈等發(fā)生自由基傳遞反應(yīng)，導致氨基酸殘基破壞產(chǎn)生羰基(醛基和酮基)[8-9]。隨著儲藏時間不同，原料豆粉的蛋白氧化程度也有差異，可能會形成醛類、酮類等物質(zhì)以影響配方粉的風味品質(zhì)，盧靜[9]的研究表明，豆粉在儲藏期間，蛋白羰基含量隨儲藏時間的延長有增加趨勢，說明豆粉中蛋白可能發(fā)生了部分氧化。而美拉德產(chǎn)物也可能是豆粉的呈味途徑，美拉德后期產(chǎn)物對豆粉品質(zhì)有重要影響，故需對不同儲藏期原料豆粉的美拉德產(chǎn)物形成規(guī)律進行分析。

目前，制備豆粉最常用的是傳統(tǒng)濕法工藝，其過程一般是將大豆浸泡后進行熱燙、磨漿、分離、煮漿處理，再經(jīng)濃縮、均質(zhì)及噴霧干燥制得豆粉[5]。本研究通過分離分級技術(shù)抽提不同儲藏期內(nèi)原料豆粉的油脂、蛋白質(zhì)等組分，通過研究確定引起兒童營養(yǎng)配方粉風味劣變的可能原因，重點分析豆粉油脂氧化、蛋白氧化及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對配方粉風味劣變的影響規(guī)律，為保持配方奶粉的原始口感、延長貨架期提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆，哈爾濱九三油脂集團；大豆磷脂，周口慧洋飼料有限公司；嬰兒配方粉，黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責任公司；實驗所需基礎(chǔ)試劑均為分析純，北京化學試劑公司。

1.2 儀器

70型漿渣分離磨漿機，沈陽玉祥機械設(shè)備有限公司；Ultra-Turrax T25高速分散器，德國IKA公司；噴霧干燥機，無錫昂益達機；AL204型分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；電熱恒溫水浴鍋，余姚市東方電工儀器廠；酶標儀SH-1000，日本Corona electric公司；RE-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海予華儀器設(shè)備有限公司；高速離心機，德國 Eppendorf 公司。

1.3 豆粉的制備

大豆→浸泡→熱燙→磨漿→漿渣混合物→漿渣分離→豆乳→酶解→滅酶→高壓均質(zhì)→調(diào)配→濃縮→噴霧干燥→豆乳粉。

參照齊寶坤等[6]的方法稱取一定量大豆于燒杯中，用濃度為0.5%的NaHCO3水溶液浸泡10 h左右后用沸水熱燙5 min，按豆水比1∶7的比例添加pH為6.5～7.0的90℃弱堿水進行磨漿得漿渣混合物，然后漿渣分離得豆乳，將分離后的豆乳在95℃下，煮漿20 min，添加2%的乳化劑大豆磷脂進行調(diào)配混勻，將調(diào)配好的豆乳進行真空濃縮至豆乳固形物含量達15%左右，然后在進口溫度為185℃、出口溫度為85℃條件下進行噴霧干燥即得豆粉，將得到的豆粉進行密封室溫保存。

1.4 兒童營養(yǎng)配方粉的制備

參照夏明敬[12]的方法，將制備的豆粉與購買的嬰兒配方粉原料按照23∶100的比例進行配比并配制成溶液，在進口溫度為180℃、出口溫度為80℃的條件下噴霧干燥，得到兒童營養(yǎng)配方粉，密封室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉油脂的提取

采用索氏抽提法利用正己烷與石油醚混合溶劑抽提豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉中的油脂，抽提溫度為55℃，抽提油脂與混合溶劑進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理，揮去混合溶劑組分獲取油脂，將抽提出的油脂置于-20℃冰箱避光備用，進行酸價、過氧化值及丙二醛值測試。

1.6 酸價、過氧化值及丙二醛值的測定

參考 GB /T 5530—2005測定酸價；參考GB /T 5538—2005測定過氧化值；參考GB/T 5009.181-2003修正優(yōu)化測定丙二醛值。

1.7 原料豆粉脂肪氧化酶活性的測定

參考石勝堯[17]等的方法，采用分光光度法對樣品中脂肪氧化酶含量進行測定，準確稱取0.10 g樣品，用5 mL蒸餾水、5 mL硼酸緩沖液溶解于試管中，緩慢振動0.5 h，用濾紙過濾，將濾液定容至50 mL容量瓶。脂肪氧化酶活性為50 000 U/mg，準確稱量0.001 9 g脂肪氧化酶，用蒸餾水定容至10 mL容量瓶中，濃度為0.001 9 g/mL。分別取0、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04 mL脂肪氧化酶加入帶有刻線的試管中，每個試管中加入0.025 mL亞油酸鈉，然后分別用硼酸緩沖液定容至3 mL，用移液槍取20 μL，于酶標儀在234 nm處測定酶反應(yīng)的吸光值，每0.5 h記錄1次吸光值，得到OD變化的最大值，以脂肪氧化酶濃度為橫坐標，ΔOD/min值為縱坐標，作出脂肪氧化酶標準曲線(圖1)。

取0.01 mL大豆提取液，加入0.025 mL亞油酸鈉，用pH為9.0的硼酸緩沖液定容至3 mL。用移液槍取20 μL，酶標儀在234 nm處測定酶反應(yīng)的吸光值，每0.5 h記錄1次吸光值，得到OD變化的最大值。樣品中的脂肪氧化酶活性按式(1)計算：

(1)

式(1)中，X-樣品中脂肪氧化酶活性(U/mg)；M-脂肪氧化酶濃度(μg/mL)；m1-樣品的質(zhì)量(μg)；V1-樣品稀釋的體積(mL)；V2-測量時取的樣品稀釋液的體積(mL)；V3-硼酸溶液定容后的體積(mL)。

1.8 原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉蛋白的提取

參照李淑芬等[10]的方法，將豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉用正己烷進行脫脂處理，然后用堿溶酸沉法提取脫脂豆粉中的蛋白，冷凍干燥后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 羰基含量的測定

參照盧靜[9]和Levine[11]等的方法，測定樣品蛋白中的羰基含量。

(2)

1.10 采用OPA法追蹤豆粉的美拉德產(chǎn)物

參考劉振春等[21]的方法，準確稱取40.0 mg的OPA溶解于1.0 mL甲醇中，再加入20%(w/w)的十二烷基硫酸鈉(SDS)2.5 mL、硼砂(0.1 mol/L)25.0 mL、β-巰基乙醇100 μL，最后用蒸餾水定容到50 mL。測定時，取4.0 mL OPA試劑于試管中，加入200 μL樣品，混合均勻，放入35℃水浴中反應(yīng)2 min后在340 nm下測吸光值A(chǔ)340，另取4.0 mL OPA試劑于試管中，加入200 μL水作為空白對照。接枝度可以用式(3)計算：

DG(%)=[(A0-A1)/A0]×100

(3)

式(3)中,A0：接枝反應(yīng)前溶液的吸光值；A1：接枝反應(yīng)后溶液的吸光值。

1.11 數(shù)據(jù)處理

每組試驗都進行3次平行試驗，并將試驗數(shù)據(jù)進行誤差分析。采用統(tǒng)計學軟件SPSS 18對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析、相關(guān)性和差異顯著性分析；采用Origin 8.5軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同儲藏期原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉油脂氧化程度變化規(guī)律

2.1.1儲藏時間對原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉酸價的影響 酸價是評價油脂氧化過程中產(chǎn)生酸性物質(zhì)量的一個有效指標，酸價可以作為評價其氧化程度的敏感指標之一[13]。由圖2可知，儲藏時間不超過8個月時，原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉的油脂酸價隨儲藏時間的延長有增加趨勢，但變化不明顯(P>0.05)，表明8個月儲藏期內(nèi)原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉的油脂氧化程度相對較低；儲藏時間超過8個月后，油脂酸價隨儲藏時間的延長顯著增加(P<0.05)，可見長期儲藏時，原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉中的油脂組分均發(fā)生了“氧化”現(xiàn)象。對比兒童營養(yǎng)配方粉與其原料豆粉可知，隨著儲藏時間的延長，兩種樣品的酸價變化趨勢相同，說明原料豆粉對兒童營養(yǎng)配方粉的油脂氧化有一定作用；儲藏時間超過8個月時，兒童營養(yǎng)配方粉提取油脂的酸價高于原料豆粉，原因可能是兒童營養(yǎng)配方粉輔料部分催化了油脂的氧化作用，其中ZnO屬于高活性氧化催化劑，以致相同儲藏期內(nèi)，兒童營養(yǎng)配方粉的酸價較高。兒童營養(yǎng)配方粉配料中的維族元素具有一定的抗氧化性，但酸價仍然較高于原料豆粉，原因可能是輔料中全脂乳粉的油脂發(fā)生了氧化，進而影響整體風味[14-15]。

圖1 脂肪氧化酶標準曲線

圖2 儲藏時間對原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉酸價的影響

圖3 儲藏時間對原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉過氧化值的影響

2.1.2儲藏時間對原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉過氧化值的影響 由圖3可知，隨著儲藏時間的延長，油脂過氧化值整體呈現(xiàn)逐漸增大的變化趨勢，說明原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉隨著儲藏期的延長均出現(xiàn)了緩慢的自動氧化作用；且兩者的過氧化值隨儲藏時間的延長有相同的變化趨勢，說明兒童營養(yǎng)配方粉在儲藏過程中的品質(zhì)劣變與原料豆粉油脂氧化有一定的相關(guān)性。儲藏8個月的原料豆粉樣品的油脂氧化值較高，此結(jié)果部分證實了油脂氧化是風味劣變的可能原因[16]。儲藏時間超過6個月時，兒童營養(yǎng)配方粉提取油脂的氧化值顯著高于原料豆粉樣品，此結(jié)果進一步證實了酸價分析中的推論。由于相同儲藏時間內(nèi)植物油脂過氧化值應(yīng)低于動物油脂，因此，本結(jié)果中兒童營養(yǎng)配方粉中油脂的過氧化值高進一步證實了全脂乳粉可能發(fā)生了較大程度氧化，并誘導了豆粉中油脂的氧化。

2.1.3儲藏時間對原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉丙二醛生成量的影響 由圖4可知，儲藏時間不超過4個月時，原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉的丙二醛生成量變化不明顯，說明短期儲藏不會影響樣品的品質(zhì)劣變；儲藏期延長到6個月時，原料豆粉的丙二醛含量增加不明顯，但兒童營養(yǎng)配方粉的丙二醛生成量顯著增加，說明兒童營養(yǎng)配方粉中的全脂乳粉發(fā)生了氧化，導致兒童營養(yǎng)配方粉的丙二醛生成量較高。儲藏時間超過6個月后，原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉丙二醛含量顯著增加(P<0.05)，說明長期儲藏時，豆粉油脂逐步氧化形成過多的氧化終產(chǎn)物，丙二醛含量增加，一定程度上導致兒童營養(yǎng)配方粉氧化程度增加，丙二醛含量增多，且相同儲藏期內(nèi)兒童營養(yǎng)配方粉的丙二醛含量相對較高，原因是植物性油脂氧化產(chǎn)生的丙二醛量較動物性油脂少，兒童營養(yǎng)配方粉中的全脂乳粉可能繼續(xù)發(fā)生氧化，以致兒童營養(yǎng)配方粉的丙二醛生成量較高。儲藏期8個月時，原料豆粉的丙二醛生成量增幅最大，原因可能是8個月左右的儲藏期是原料豆粉末端氧化發(fā)生的重點時期，也是“氧化味”產(chǎn)生的主要時期。

2.1.4儲藏時間對原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉脂肪氧化酶活性的影響 由圖5可知，隨著儲藏時間的延長，原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉中的脂肪氧化酶活性并未發(fā)生顯著變化。說明原料奶粉及兒童營養(yǎng)配方粉風味劣變的原因并非源自酶促氧化，結(jié)合脂肪氧化程度結(jié)果分析可知，品質(zhì)劣變可能是由脂肪的自動氧化引起，在長期儲藏下，原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉的脂肪氧化程度逐漸增大，可能與脂肪氧化的鏈式反應(yīng)有關(guān)[18-19]，油酸、亞油酸、亞麻酸氧化產(chǎn)生醛類物質(zhì)及氫過氧化物，這些物質(zhì)經(jīng)過裂解產(chǎn)生己醛，進一步反應(yīng)會導致原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉風味劣化[15]。

2.2 不同儲藏期原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉蛋白氧化程度的變化規(guī)律

由附表可知，原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉的蛋白質(zhì)羰基含量隨儲藏時間的延長有增加趨勢，但變化不明顯。由劉晶[20]的研究結(jié)果可以看出，丙二醛含量增加會引起大豆蛋白羰基含量增加，說明原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉的脂肪氧化可能促進蛋白的氧化，以致蛋白羰基含量增加，但蛋白羰基含量在儲藏期間變化不明顯，說明蛋白氧化并非是影響兒童營養(yǎng)配方粉風味劣變的主要原因。

附表 蛋白氧化程度結(jié)果

2.3 不同儲藏期原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉美拉德產(chǎn)物的形成規(guī)律

接枝度的高低反映了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物形成的多少，接枝度較高，表明樣品發(fā)生美拉德反應(yīng)的程度較強。由圖6可知，原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉的接枝度隨儲藏時間的延長有增加趨勢，但變化不明顯，說明美拉德反應(yīng)對原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉品質(zhì)劣變的影響較小。通過對比發(fā)現(xiàn)，原料豆粉與兒童營養(yǎng)配方粉在加工過程中美拉德產(chǎn)物形成差異不明顯，說明儲藏期間兒童營養(yǎng)配方粉發(fā)生的美拉德反應(yīng)主要是由原料豆粉引起的。

圖4 儲藏時間對原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉丙二醛生成量的影響

圖5 儲藏時間對原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉脂肪氧化酶活性的影響

圖6 儲藏時間對原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉美拉德反應(yīng)的影響

3 結(jié)論

本文對不同儲藏期間兒童營養(yǎng)配方粉及其原料豆粉的油脂及蛋白成分進行了研究，通過油脂的過氧化值、酸價、丙二醛含量分析不同儲藏期的油脂氧化程度；采用分光光度法對脂肪氧化酶活性進行測定；通過羰基含量的測定，確定不同儲藏期內(nèi)樣品的蛋白氧化程度；采用OPA法豆粉追蹤美拉德產(chǎn)物，確定美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對配方粉風味劣變的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，儲藏期間原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉的品質(zhì)劣變主要是由油脂自動氧化引起的，蛋白質(zhì)氧化和美拉德反應(yīng)對原料豆粉及兒童營養(yǎng)配方粉品質(zhì)劣變影響較??；且原料豆粉與兒童營養(yǎng)配方粉的油脂氧化變化趨勢相同，對兒童營養(yǎng)配方粉的品質(zhì)劣變有一定促進作用，但全脂乳粉可能也對兒童營養(yǎng)配方粉的油脂氧化變質(zhì)有一定作用?！?/p>