熊挺淋 張麗莎 王浩宇 劉 濤

(南充市中心醫(yī)院心內(nèi)科 川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000)

心肌細(xì)胞(CM)是一種終末分化細(xì)胞，心肌梗死或者其他創(chuàng)傷導(dǎo)致CM死亡，其損傷是不可逆的。目前治療CM損傷性疾病是困擾臨床醫(yī)生的一大難題，主要采取組織或者細(xì)胞移植，組織移植包括自體心肌組織移植及異體心臟移植，胚胎干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞已證實(shí)能分化為CM〔1，2〕而用于細(xì)胞移植等。但胚胎干細(xì)胞用于移植治療一直存在著道德倫理及免疫排斥反應(yīng)等需要解決的問題。Takahashi等〔3〕將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)成功重編程為多能性細(xì)胞——誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)，iPSCs無論在生長特點(diǎn)、細(xì)胞形態(tài)、表達(dá)的標(biāo)志物及形成畸胎瘤等方面均與胚胎肝細(xì)胞非常相似，且解決了胚胎肝細(xì)胞移植治療時存在的免疫排斥及道德倫理難題。Mauritz等〔4〕研究證實(shí)小鼠iPSCs可以在特定的體外培養(yǎng)條件下定向分化為CM，但在體內(nèi)特定條件下其能否分化為CM，目前未見相關(guān)研究報(bào)告。本研究觀察iPSCs移植治療對心肌梗死小鼠心臟的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1材料 成年昆明小鼠及受孕13.5 d的昆明小鼠均由川北醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因(Oct-4)小鼠來源的iPSCs株購自中國科學(xué)院動物研究所北京干細(xì)胞庫。 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自Hyclone公司，水合氯醛、非必需氨基酸、二甲亞砜均購自Sigma，β-巰基乙醇購自天津TBD公司，絲裂霉素C購自Roche公司，白血病抑制因子購自上海欣百諾公司，山羊來源的心肌肌鈣蛋白(cTn)T一抗、四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)標(biāo)記的兔抗羊熒光二抗購自Santa Cruz公司，兔抗鼠縫隙連接蛋白(Cx)-43一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自北京中杉金橋公司。簡易呼吸機(jī)由川北醫(yī)學(xué)院生理教研室提供，BL-420多導(dǎo)電生理儀及生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)為成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)，體式鏡XTL-3A Coic由重慶光學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2iPSCs及原代CM的培養(yǎng)及鑒定 iPSCs的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代和原代CM的提取、培養(yǎng)及兩種細(xì)胞的鑒定同熊挺淋〔5〕法。

1.3小鼠急性心肌梗死(AMI)模型的建立及判定 水合氯醛腹腔麻醉成年昆明小鼠，然后通過氣管切開由簡易呼吸機(jī)輔助通氣。通氣成功后，胸骨左緣第4肋間隙剪斷肋骨，進(jìn)入胸腔，鈍性分離心包并剪開，體式鏡下用結(jié)扎線結(jié)扎前降支，結(jié)扎后成功的標(biāo)志為結(jié)扎血管供應(yīng)區(qū)心肌組織變蒼白，體表心電圖監(jiān)測示相關(guān)導(dǎo)聯(lián)ST段抬高大于0.1 mV(圖1)。待移植細(xì)胞成功后，逐層關(guān)閉及縫合胸腔，待小鼠恢復(fù)自主呼吸后，撤去簡易呼吸機(jī)。術(shù)后給予手術(shù)小鼠肌肉注射青霉素以預(yù)防感染〔6〕。

圖1 心肌梗死模型及體表心電圖

1.4實(shí)驗(yàn)分組 心肌梗死造模成功的昆明小鼠共36只，隨機(jī)分為AMI組、AMI+iPSCs組、AMI+CM組，每組12只；12只正常成年昆明小鼠設(shè)為正常對照(NC)組。AMI組：只建立心肌梗死模型，不移植iPSCs及原代CM；AMI+iPSCs組：將iPSCs移植入心肌梗死區(qū)；AMI+CM組：將原代CM移植入心肌梗死區(qū)；NC組：既不建立心肌梗死模型，也不移植細(xì)胞。

1.5細(xì)胞移植 分別收集iPSCs及原代CM，制備成細(xì)胞懸液，小鼠冠脈前降支結(jié)扎后30 min時，用微量注射器吸取移植細(xì)胞懸液2.5 μl注射入心肌肌層，每個缺血壞死區(qū)域分別注射4次〔6〕。

1.6心電圖及血流動力學(xué)的監(jiān)測 正確連接多導(dǎo)電生理儀，采用BL-420多導(dǎo)電生理儀及生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，分別于細(xì)胞移植后1 h、1 d、7 d、14 d、21 d時測動脈收縮壓及動脈舒張壓〔6〕。急性ST段抬高型心肌梗死，其抬高的ST段一般在7 d內(nèi)回落至基線，因此分別在細(xì)胞移植后1 h、1 d、2 d、5 d及7 d時檢查體表心電圖。

1.7免疫組化檢測Cx-43的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)后第21天，開胸切取各組心肌梗死區(qū)心肌組織，采用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，然后切片。采用中杉金橋公司SP法免疫組化試劑盒進(jìn)行染色操作。應(yīng)用Image Pro Plus圖像分析軟件對目的蛋白進(jìn)行分析。選擇5個高倍鏡視野計(jì)算平均光密度值，取平均值作為Cx-43的相對表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1iPSCs和原代CM形態(tài)觀察及鑒定 小鼠iPSCs在飼養(yǎng)層細(xì)胞上呈集落狀圓形或者橢圓島狀生長，其內(nèi)細(xì)胞生長緊密，同時iPSCs在熒光顯微鏡下觀察，呈現(xiàn)出與光學(xué)顯微鏡對應(yīng)的、一致的集落狀綠色細(xì)胞團(tuán)。CM呈多邊形、三角形或者扁平不規(guī)則等形態(tài)，培養(yǎng)第3天起，可見小部分收縮的CM，收縮頻率在30～50次/min，細(xì)胞免疫熒光染色后，胞質(zhì)內(nèi)可見發(fā)紅色熒光的心肌特異性蛋白cTnT(圖2)。

2.2iPSCs移植對小鼠心率的影響 造模前各組心率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而造模成功后初期(7 d內(nèi))，各組小鼠心率均有輕度升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)第14天及21天，AMI+iPSCs組小鼠心率較造模成功后初期明顯降低(P<0.05)；細(xì)胞移植第14天后，AMI+iPSCs組小鼠心率明顯低于同時間點(diǎn)的AMI+CM組、AMI組及NC組小鼠心率(P<0.05)。而AMI+CM組、AMI組和NC組小鼠心率，造模前后差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3iPSCs移植對心電圖ST段的影響 iPSCs移植后1 h及第1天時，AMI+iPSCs組體表心電圖ST段抬高程度與AMI組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；移植后第2天、第5天及第7天時，AMI+iPSCs組ST段抬高程度較AMI組明顯降低(P<0.05)。而相同時間點(diǎn)的AMI+CM組及AMI組的ST段抬高程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。細(xì)胞移植后第2天起，AMI+iPSCs組ST段抬高程度較AMI+CM組明顯下降(P<0.05)。見表2。

2.4iPSCs移植對血壓的影響 與NC組相比，AMI+iPSCs組血壓無明顯下降(P>0.05)，而AMI+CM組及AMI組血壓明顯下降(P<0.05)；與AMI+iPSCs組相比，AMI+CM組及AMI組血壓也明顯下降(P<0.05)。見表3。

圖2 iPSCs及原代CM形態(tài)及鑒定(×400)

時間造模前造模后1 h1 d7 d14 d21 dAMI+iPSCs組424.50±42.76430.43±32.671)437.88±43.151)420.12±29.801)375.08±31.84385.64±22.77AMI+CM組418.42±36.71422.45±26.67423.90±33.81418.32±27.91417.03±22.232)420.45±30.462)AMI組426.88±29.02428.22±29.37419.20±38.78410.26±29.68417.28±30.122)412.55±40.002)NC組416.48±29.28420.36±28.70415.19±38.94418.34±35.62416.34±31.562)411.22±28.732)

與第14天及21天比較：1)P<0.05；與AMI+iPSCs組比較：2)P<0.05

表2 移植后不同時間點(diǎn)各組體表心電圖ST段抬高程度比較

與AMI組相比：1)P<0.05；與AMI+CM組相比：2)P<0.05

表3 各組血壓比較

與NC組相比：1)P<0.05；與AMI+iPSCs組相比：2)P<0.05

2.5免疫組化分析 iPSCs移植后第7天，缺血壞死周圍可見iPSCs植入，與正常心肌組織緊密結(jié)合，iPSCs稍呈集落狀生長。見圖3。定量分析顯示，移植后第21天，AMI+iPSCs組Cx-43平均吸光度(0.154±0.063)明顯高于AMI組(0.022±0.033)(P<0.05)；而AMI+CM組Cx-43平均吸光度值(0.019±0.010)與AMI組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 心肌組織中的iPSCs及Cx-43免疫組化染色

3 討 論

許多體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)iPSCs能夠定向分化為CM，其分化CM不論在細(xì)胞形態(tài)及表達(dá)特異性標(biāo)志物方面均與原代CM相似〔4，7，8〕。Strauer 等〔9〕研究表明，骨髓單個核細(xì)胞移植治療10 w后，心肌梗死面積由24.6%下降至15.7%，射血分?jǐn)?shù)、心臟指數(shù)增加了20%～ 30%，運(yùn)動時的舒張末期容量下降30%，左室充盈壓相對下降，移植治療后沒有出現(xiàn)新的心肌缺血、炎癥反應(yīng)和惡性心律失常等不良反應(yīng)。此外，該研究團(tuán)隊(duì)還首次證明了經(jīng)冠狀動脈內(nèi)輸入自體骨髓單個核細(xì)胞治療AMI是安全可行的〔10，11〕。本實(shí)驗(yàn)表明，一定數(shù)量的iPSCs移植可在一定程度上改善心肌梗死小鼠心臟功能，并使移植區(qū)域Cx-43蛋白表達(dá)增加。

既往研究表明，永久性結(jié)扎冠狀動脈法與冰凍損傷或者暫時阻斷冠狀動脈的方法相比，這一技術(shù)更接近心肌梗死發(fā)生的病理生理過程，并且不會發(fā)生缺血再灌注時更為嚴(yán)重的惡性心律失?！?2〕。經(jīng)外周靜脈注射移植，只有很少一部分的移植細(xì)胞能到達(dá)心肌梗死區(qū)；而且長時間的血液內(nèi)循環(huán)過程中，有部分移植細(xì)胞會發(fā)生向脾、肝、肺等臟器歸巢的現(xiàn)象〔13〕。采用直接開胸心肌注射法，可以使移植細(xì)胞在注射后首先在梗死區(qū)及梗死周邊區(qū)停留，因而能夠使細(xì)胞移植效果最大化。iPSCs分化來源的心臟血管平滑肌細(xì)胞，具有成熟心肌細(xì)胞的興奮性、收縮性、自律性和電位穩(wěn)定性等特點(diǎn)〔14〕，同時，干細(xì)胞移植可增加細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等的釋放，促進(jìn)缺血區(qū)新生毛細(xì)血管的生成，增加心肌灌注、改善心室重構(gòu)及減少心室擴(kuò)張，因而有利于細(xì)胞的存活和增殖〔15〕?；谝陨涎芯坷碚?，本實(shí)驗(yàn)表明心肌梗死后無泵衰竭發(fā)生，提示iPSCs移植后可改善心肌梗死小鼠心功能。

由Cx-43構(gòu)成的縫隙連接通道的主要作用是形成細(xì)胞間快速的電沖動，以保證心臟整體電活動的同步性和協(xié)調(diào)性，心臟正常的電活動取決于Cx-43的正常表達(dá)與分布，而一旦其表達(dá)與分布發(fā)生異常，即Cx-43發(fā)生重構(gòu)，必然會引起CM的電耦聯(lián)障礙，導(dǎo)致室性心律失常發(fā)生。目前iPSCs移植后能否與宿主細(xì)胞形成一個有收縮功能的相對電獨(dú)立體系，尚缺乏系統(tǒng)觀察，移植細(xì)胞與宿主心肌是否能夠產(chǎn)生縫隙連接目前也尚無相關(guān)報(bào)道。而本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了iPSCs移植后可使小鼠心肌梗死區(qū)Cx-43的表達(dá)增加。

本研究僅從血壓、心率、心電圖ST段變化及Cx-43的表達(dá)方面探討了iPSCs移植對心肌梗死小鼠的心臟保護(hù)作用，并未探討iPSCs移植的最佳時間窗，細(xì)胞移植是否像血運(yùn)重建一樣，越早越好？還是選在心肌梗死后炎癥反應(yīng)劇烈時，有利于干細(xì)胞歸巢？或是選在心肌梗死后炎癥病理反應(yīng)消退時？并未探討不同干細(xì)胞移植方法對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。所有這些問題有待進(jìn)一步研究。