張鐿萱，葛茂旭，張娜，牛偉曉，鮑云洋，趙午莉，劉虹，邵榮光，何紅偉

慢性肝臟疾病是一類嚴(yán)重危害人類健康的疾病，其中肝纖維化是多種原因（如病毒感染、藥物誘導(dǎo)、自身免疫、膽汁淤積等代謝疾?。┧鸬穆愿尾〉墓餐±韺W(xué)基礎(chǔ)，是形成肝硬化乃至肝癌的必經(jīng)病理階段，其特征是肝星狀細(xì)胞（HSC）的大量增殖與活化，星狀細(xì)胞活化會大量分泌膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶、TGF-β 等肝纖維化相關(guān)蛋白，導(dǎo)致膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）在肝內(nèi)過度沉積[1]。隨著對肝纖維化機(jī)制研究的不斷深入，越來越多的研究證明肝纖維化具有可逆性[2]，這對于控制肝臟疾病惡性發(fā)展的防治有重要意義。

鹽酸石蒜堿（lycorine hydrochloride，LH）是石蒜科植物石蒜的鱗莖內(nèi)的生物堿。近年來的研究證明，鹽酸石蒜堿具有抗炎、止痛、抗病毒、抗瘧疾、保護(hù)心血管、抗腫瘤等功效[3-5]，而其在肝纖維化領(lǐng)域中的研究未見報(bào)道。因此，本研究從探索鹽酸石蒜堿抗肝纖維化的活性出發(fā)，展開了相關(guān)的藥效和機(jī)制研究。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞培養(yǎng)所需的 DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國 Gibco 公司；雙抗混合物（青霉素與鏈霉素）、轉(zhuǎn)染試劑 lipofectamine2000、Trizol 購自美國 Invitrogen 公司；G418 購自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；TGF-β1 購自美國 R & D 公司；人肝星狀細(xì)胞 LX2 為本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)；磺酰羅丹明 B（SRB）購自美國 Sigma 公司；Bright-GloTMLuciferase Assay System 購自美國 Promega 公司；Nucleo Spin RNA Clean-up 試劑盒購自德國Macherey-Nagel 公司；AffinityScript Multiple Temperature cDNA Synthesis Kit 購自美國 Agilent Technologies 公司；FastStart Universal Probe Master（Rox）購自瑞士 Roche 公司；Taqman 引物和探針購自美國 Applied Biosystem 公司；抗體GAPDH、p-Smad2、Smad2、Smad4、P-Akt、α-SMA購自美國 Cell Signaling Technology 公司；抗體collagen I、TGF-β1 購自美國 Abcam 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；化學(xué)發(fā)光HRP 底物購自美國 Millipore 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)所用人肝星狀細(xì)胞系 LX2用含 10% FBS 和 1% 青霉素/鏈霉素的DMEM/GlutaMAXTM于 37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測鹽酸石蒜堿的活性應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的 I 型膠原 α1（COL1A1）啟動子-熒光素酶報(bào)告檢測系統(tǒng)[6]。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了pGL4.17-COL1A1P 的 LX2-COL 細(xì)胞接種于 96 孔板，培養(yǎng) 24 h 后以 1、10 和 100 μmol/L 不同濃度梯度給藥，24 h 后用熒光素酶試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.2.2 體外細(xì)胞毒生物活性測定 SRB 蛋白比色法檢測化合物毒性和對細(xì)胞增殖的影響。LX2 細(xì)胞接于 96 孔板，不同濃度梯度給藥，24 h 后用 50%（W/V）TCA 按照 1∶4 的體積加入 96 孔板中進(jìn)行固定過夜，清水洗凈后用 0.4%（W/V）SRB 染色 15 min，然后用 1% 乙酸漂洗，最后用非緩沖Tris-base 堿液（10 mmol/L，pH10.5）溶解，酶標(biāo)儀測定 570 nm 處光密度值（OD）。根據(jù)藥物濃度和抑制率，利用 SigmaPlot10.0 軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.3 實(shí)時熒光定量 LX2 細(xì)胞接于 6 孔板，匯合度接近 90% ～ 95% 時，用無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng) 24 h 后，給藥同時加 TGF-β1（2 ng/ml）誘導(dǎo)，24 h 后收集細(xì)胞。用 Trizol 提取總 RNA，用NucleoSpin RNA Clean-up 試劑盒純化，取 1 μg 樣品逆轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，以 3 μl cDNA 為模板，0.5 μl Taqman 探針引物（MMP2 上游引物：CCTACACC AAGAACTTCCGTCTGT，下游引物：ATGTCAGGA GAGGCCCCATAG，探針：CAGGATGACATCAAG GGCATTCAGGAGC；COL1A1 上游引物：CCAGA AGAACTGGTACATCAGCAA，下游引物：CCGCC ATACTCGAACTGGAA，探針：CCCCAAGGACAA GAGGCATGTCTGGTT。GAPDH、TGF-β1 版權(quán)屬于美國 Applied Biosystem 公司，序列未公開），10 μl FastStart Universal Probe Master（Rox）和水配制成 20 μl 反應(yīng)體系，進(jìn)行實(shí)時熒光定量 PCR 儀檢測。

1.2.4 Western blot 檢測 收集經(jīng)過 24 h 處理的LX2 細(xì)胞，用 PBS 沖洗 2 遍，加入 RIPA 裂解液，4 ℃ 裂解 30 min，12 000 ×g、4 ℃ 離心 20 min，收集上清液，BCA 法測定蛋白含量后等量分裝。SDS-PAGE 凝膠電泳將不同分子量的蛋白質(zhì)分離，然后用濕轉(zhuǎn)法將膠上的蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)移到預(yù)處理后的 PVDF 膜上。在含 5% 脫脂奶粉的 PBST 中輕輕晃動封閉 1 h，4 ℃ 一抗孵育過夜后 PBST 洗膜 3 次后，將膜與合適稀釋濃度的二抗結(jié)合，室溫孵育 2 h 后 PBST 洗膜 3 次，加上 HRP 底物發(fā)光液，通過 FLUORchem HD2 凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s形式表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，最終統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P＜0.05 為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 單熒光素酶檢測藥物活性

COL1A1 的大量表達(dá)與過度沉積是肝纖維化的重要特征。本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究工作中構(gòu)建了重組人 COL1A1 啟動子的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL4.17-hCOL1A1P，用來在體外篩選化合物的抗肝纖維化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以 (-)-表沒食子兒茶素 沒 食子酸 酯 [(–)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG]為陽性藥做對照，不同濃度的鹽酸石蒜堿（1、10 和 100 μmol/L）對 COL1A1 啟動子的活性抑制率分別為（15.2 ± 7.15）%、（46.22 ± 9.11）% 和（88.75 ± 5.62）%（圖 1）。

圖 1 LH 抑制 COL1A1 啟動子活性Figure 1 LH inhibited COL1A1 promoter activity

2.2 鹽酸石蒜堿抑制肝星狀細(xì)胞 LX2 的細(xì)胞增殖

為了在體外檢測鹽酸石蒜堿的抗肝纖維化活性，本研究首先利用 SRB 比色法檢測了鹽酸石蒜堿的毒性和對體外培養(yǎng) LX2 細(xì)胞增殖的影響，以確定鹽酸石蒜堿體外作用的有效濃度范圍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的鹽酸石蒜堿（0.3、1、3、10、30 和 100 μmol/L）作用 24 h 后，LX2 細(xì)胞的存活率分別為（93.43 ± 1.90）%、（75.91 ± 3.68）%、（66.68 ± 1.07）%、（52.20 ± 3.03）%、（32.48 ±0.57）%、（18.33 ± 3.23）%（圖 2），即鹽酸石蒜堿能劑量依賴性地抑制 LX2 細(xì)胞的增殖。鹽酸石蒜堿對 LX2 細(xì)胞作用的 IC50值為（9.79 ±1.02）μmol/L。

2.3 鹽酸石蒜堿抑制肝星狀細(xì)胞 LX2 的活化

除了考察鹽酸石蒜堿對肝星狀細(xì)胞 LX2 的增殖抑制作用以外，我們還采用 TGF-β1 誘導(dǎo) LX2細(xì)胞活化的同時進(jìn)行加藥處理，通過 qRT-PCR 和Western blot 檢測肝纖維化相關(guān)基因 TGF-β1、COL1A1 和金屬機(jī)制蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）mRNA 的變化以及TGF-β1、α-SMA、MMP2 和 COL1A1 蛋白的變化，從而評價其對 LX2 細(xì)胞活化的抑制效果。結(jié)果顯示，TGF-β1 誘導(dǎo)后經(jīng)過不同濃度鹽酸石蒜堿處理，可以顯著下調(diào) TGF-β1、MMP2、α-SMA、COL1A1 mRNA 水平（圖 3A）和（或）蛋白水平（圖 3B）的表達(dá)，并呈現(xiàn)劑量依賴性。結(jié)果表明，鹽酸石蒜堿具有良好的體外抑制肝纖維化的作用。

2.4 鹽酸石蒜堿抑制 Akt/Smad 信號通路活性

TGF-β 主要通過經(jīng)典的 Smad 依賴的途徑（即 TGF-β/Smad 信號通路）調(diào)控肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[7-8]。Smad 蛋白是 TGF-β 信號傳入 HSC 細(xì)胞核的關(guān)鍵蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，Smad2 的過度表達(dá)與纖維結(jié)合蛋白和 I 型膠原沉積的增加密切相關(guān)[9]，有研究證明 TGF-β 受體還可以通過磷酸化或與信號中間體結(jié)合激活包括磷脂酰肌醇激酶 PI3K/Akt等信號通路[10]，本實(shí)驗(yàn)室先前的研究也證明了 Akt可以影響 TGF-β/Smad 信號通路的激活[11]。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)鹽酸石蒜堿可以顯著地抑制肝纖維化標(biāo)志性蛋白 COL1A1 的表達(dá)。而 COL1A1的表達(dá)可被 TGF-β 信號通路調(diào)控。因此檢測了鹽酸石蒜堿對 TGF-β 誘導(dǎo)后 Akt/Smad 信號通路的影響。Western blot 結(jié)果顯示，TGF-β1 誘導(dǎo)后，Akt 和 Smad2 途徑的磷酸化水平顯著升高，而在 TGF-β1 誘導(dǎo)的同時給予鹽酸石蒜堿，Akt和 Smad2 磷酸化水平降低，且與藥物濃度正相關(guān)（圖 4）。由此我們認(rèn)為鹽酸石蒜堿可能通過抑制Akt/Smad 途徑的磷酸化水平發(fā)揮其抗肝纖維化的作用。

圖 2 LH 抑制 LX2 細(xì)胞增殖Figure 2 LH decreased the survival of hepatic stellate cell LX2

圖 3 LH 顯著降低 LX2 細(xì)胞中纖維化標(biāo)志基因（A）和蛋白質(zhì)的表達(dá)（B）Figure 3 LH significantly reduced the expression of fibrotic marker gene (A) and proteins in human HSC line LX2 (B)

3 討論

我國是一個肝病高發(fā)國家，除 HBV、HCV 高感染率外，酒精肝、脂肪肝和藥物性肝等的發(fā)病率也逐年上升。慢性肝病已經(jīng)給家庭和社會造成了嚴(yán)重的影響，亟需開發(fā)出能用于臨床的高效且無明顯毒副作用的抗肝纖維化的藥物。肝星狀細(xì)胞是肝纖維化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

石蒜堿是一種從石蒜科植物中提取的生物堿，因其具有明顯的生長抑制能力，如誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12-14]和細(xì)胞周期阻滯[15-17]和抑制血管生成[4]，被認(rèn)為是一種潛在的抗癌藥物[18]，對前列腺癌[12]、多發(fā)性骨髓瘤[15]、卵巢癌[16]、肺上皮癌[19]、白血病[13-14,17]和黑素瘤[4,20]均有明顯抑制作用。而鹽酸石蒜堿在抗肝纖維化的研究中尚未見報(bào)道，本研究通過實(shí)驗(yàn)室已有的肝纖維化篩選模型篩選發(fā)現(xiàn)，鹽酸石蒜堿具備抗肝纖維化的活性。

肝星狀細(xì)胞是肝纖維化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，其激活后會大量增殖，同時分泌大量細(xì)胞因子、膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶等肝纖維化相關(guān)的蛋白。在本研究中，通過 SRB 法檢測發(fā)現(xiàn)，LH 有明顯抑制肝星狀細(xì)胞增殖的活性。

在肝纖維化中，TGF-β/Smad 和 PI3K/Akt 兩條信號通路至關(guān)重要，并且有一定交叉調(diào)控作用。Akt 可以通過促進(jìn) Smad2/3 的磷酸化及其向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移來增強(qiáng) TGF-β/Smad 信號通路的調(diào)控作用，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，膠原沉積和 α-SMA 的表達(dá)[21]。同時，TGF-β 可以快速激活 PI3K/Akt 的磷酸化，隨后影響其下游靶標(biāo)的磷酸化來促進(jìn)細(xì)胞生長和存活，這種激活似乎與 Smad2/3 激活無關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室通過使用 PI3K 抑制劑 LY294002 證明了 PI3K/Akt/Smad 信號通路在肝纖維化中發(fā)揮的作用[11]。本研究同樣證明了 LH 可以通過抑制 Akt蛋白表達(dá)來降低 Smad2 的磷酸化水平，削弱了TGF-β/Smad 信號通路的影響，即通過 Akt/Smad信號通路發(fā)揮抗肝纖維化作用。研究證明了鹽酸石蒜堿不僅能抑制肝星狀細(xì)胞的增殖，還能夠抑制其活化，這種作用是通過抑制 Akt/Smad 通路活性實(shí)現(xiàn)的。這些結(jié)果提示鹽酸石蒜堿有較好的抗肝纖維化活性，有成為潛在治療肝纖維化藥物的可能。