洪恩宇，王雅頔，任慧敏，耿迪，楊慧，鄭惠文，楊業(yè)然，金雅瓊，魯潔，郭永麗，于永波

作者單位：100045 北京，國家兒童醫(yī)學中心（北京）首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院/北京市兒科研究所/兒童耳鼻咽喉頭頸外科疾病北京市重點實驗室（洪恩宇、王雅頔、任慧敏、耿迪、楊慧、鄭惠文、楊業(yè)然、金雅瓊、魯潔、郭永麗、于永波），兒童臨床數(shù)據(jù)和樣本資源庫（洪恩宇、王雅頔、任慧敏、耿迪、楊慧、郭永麗、于永波）

在臨床和科研工作中，血液和組織是比較容易獲取的生物標本，特別適用于臨床和實驗室檢測及生物樣本庫收集保存。DNA、RNA 和蛋白質(zhì)是三種重要的生物大分子，其中RNA 在人類多種生理和病理過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。RNA 通常是從組織、全血和培養(yǎng)的細胞中提取獲得[1]，高質(zhì)量 RNA 可滿足 RT-PCR、Northern blot、基因表達譜、轉(zhuǎn)錄組測序和陣列分析等生物學實驗的研究需求[2-3]。由于RNA 自身結(jié)構(gòu)特性[4]和環(huán)境中廣泛分布核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）[5]，同時 RNA 提取質(zhì)量亦受到標本類型、儲存溫度、儲存時間、凍融次數(shù)和處理方式等影響，使得從血液、組織和培養(yǎng)的細胞中抽提 RNA 以及 RNA的穩(wěn)定保存相對困難。

目前，有關(guān) RNA 質(zhì)量的影響因素研究主要集中于樣本類型、儲存溫度和時間等方面，但是儲存溫度和時間對 RNA的影響仍然沒有統(tǒng)一的結(jié)論[6-7]，而且，RNA 反復凍融對其質(zhì)量的影響也未見報道。本文從臨床檢測和臨床資源樣本庫標本存儲的需求出發(fā)，旨在探討血液標本采集后在 4 ℃ 及常溫放置不同時間，評估其對血液標本 RNA 質(zhì)量的影響；另外，通過反復凍融 RNA，研究 RNA 凍融次數(shù)對其質(zhì)量影響，以期為臨床檢測和樣本庫標本的存儲提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要設(shè)備 生物安全柜和 NanoDrop 購自美國Thermo 公司；4 ℃ 和 –80 ℃ 冰箱購自 Sanyo 公司；高速冷凍離心機和恒溫混勻儀購自 Eppendorf 公司；G2939A生物分析儀購自 Agilent 公司；采血管購自美國 BD 公司；RNase free 離心管和槍頭購自美國 Axygen 公司；RNase free 凍存管購自德國 Sarstedt 公司。

1.1.2 主要試劑 血液（液體樣本）總 RNA 快速提取試劑盒（離心柱型）購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；AllPrep DNA/RNA Mini Kit 購自美國 Qiagen 公司；RNA 6000 Nano 總 RNA 分析試劑盒及芯片購自美國 Agilent公司；氯仿和 β-巰基乙醇等試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標本采集與分組 在獲取知情同意書后，采集首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院 3 例健康成人（志愿者）血液標本各 4 ml，使用 EDTA 抗凝管保存，采集后至生物安全柜中進行分裝，以上操作均為無菌操作。組織標本為首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院手術(shù)切除的患兒組織樣本（神經(jīng)母細胞瘤瘤體）3 例，在組織離體 30 min 內(nèi)，采集組織標本，并迅速置于液氮中保存，以上操作均為無菌操作，并已獲取相關(guān)知情同意書。

1.2.2 樣本分組

⑴血液樣本 4 ℃ 放置組：血液樣本按照 0.25 ml/管分裝于 RNase free 離心管中并編號，4 ℃ 放置。樣本分別在0、1、2、4、12、24、48、72 h 及 1 周時提取 RNA。

⑵血液樣本常溫放置組：血液樣本按照 0.25 ml/管分裝于 RNase free 離心管中并編號，常溫放置。樣本分別在 0、4、12、24 及 48 h 時提取 RNA。

⑶組織 RNA 反復凍融組：組織樣本提取 RNA 后混勻，分裝于 RNase free 凍存管中并編號，–80 ℃ 冰箱保存。將 RNA 置于冰上融化 1 h，待其完全融化后放回 –80 ℃保存，重復此操作（每天凍融 2 次）。我們預實驗將 RNA 凍融多次（1 次、3 次、5 次和 10 次），但各凍融次數(shù)之間結(jié)果沒有差異，為尋找 RNA 反復凍融后質(zhì)量出現(xiàn)變化的臨界點，我們進而增加凍融次數(shù)：即反復凍融 1 次、11 次、26 次及 41 次。

1.2.3 總 RNA 提取

⑴血液樣本 RNA 提取嚴格按照操作說明書進行，主要操作步驟如下：每 0.25 ml 全血樣本中加入 0.75 ml 裂解液裂解細胞，在 25 ℃ 下孵育 5 min，再加入 0.2 ml 氯仿離心分層，吸取無色水相和中間層置于新的離心管中，加入等體積 70% 乙醇，加入去蛋白液、漂洗液去除蛋白及殘留乙醇，最后加 50 μl RNase free water 溶解 RNA，行 RNA濃度及純度檢測。

⑵組織樣本 RNA 提取嚴格按照操作說明書進行，主要操作步驟如下：每 30 mg 組織樣本加入 0.6 ml 緩沖液RLT 和 β-巰基乙醇混合液，組織研磨器破碎后離心，吸取上層勻漿至帶有收集管的過濾柱中，離心，加入等體積 70%乙醇，離心，再加入緩沖液 RW1、緩沖液 RPE 去除蛋白及殘留乙醇，最后加 40 μl RNase free water 溶解 RNA，行RNA 濃度及純度檢測。

1.2.4 RNA 濃度和純度檢測 取 2 μl RNA 樣本，使用核酸蛋白檢測儀 NanoDrop 檢測 RNA 濃度及OD260/OD280值，比值在 1.8 ～ 2.1 范圍內(nèi)，表明 RNA 純度較好，比值＜ 1.8 表明有 DNA、蛋白質(zhì)污染，比值 ＞ 2.1 表明 RNA 降解或有異硫氰酸胍等物質(zhì)污染。

1.2.5 RNA 完整性檢測 使用 Agilent 2100 生物分析儀檢測 RNA 完整性，采用毛細管電泳法對 28S 和 18S rRNA 通過軟件量化，得反映 RNA 完整性的 RIN 值。RIN值一般在 10（最佳質(zhì)量）至 0（完全降解）之間[8]。

1.3 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用 SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以±s表示，各組間差異比較采用單因素方差分析，設(shè)定P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血液樣本 4 ℃ 不同放置時間對 RNA 質(zhì)量的影響

使用 NanoDrop 分光光度計檢測 RNA 的濃度、純度，使用生物分析儀檢測 RNA 的完整性，結(jié)果如表 1 所示，RNA 濃度范圍在 55.13 ～ 64.10 ng/μl 之間，并且隨著時間的延長，出現(xiàn)下降的趨勢，但是并沒有統(tǒng)計學差異；RNA 純度OD260/OD280比值在 1.94 ～ 2.01 間變化較??；RIN 是比OD260/OD280更靈敏的反映 RNA 質(zhì)量的指標。RIN 值在7.77 ～ 10.00 之間，其中，1 周的血液 RNA 完整性與 0 h比較具有統(tǒng)計學差異（P＜ 0.05）。圖 1 所示為血液樣本在4 ℃ 放置不同時間對 RNA 影響的電泳圖，顯示隨著放置時間的延長，RNA 存在降解現(xiàn)象。以上結(jié)果表明，血液樣本 4 ℃ 放置 1 周對 RNA 的濃度和純度沒有顯著性影響，但是對 RNA 的完整性有影響。

表 1 血液樣本 4 ℃ 不同放置時間對 RNA 濃度、純度及完整性影響

2.2 血液樣本常溫不同放置時間對 RNA 質(zhì)量的影響

如表 2 所示，血液樣本在常溫放置 48 h 以內(nèi)，RNA濃度范圍在 76.60 ～ 82.54 ng/μl 之間，隨著放置時間的延長呈現(xiàn)無規(guī)律變化，各時間組與 0 h 組相比也無統(tǒng)計學差異；RNA 純度OD260/OD280值在 1.97 ～ 1.99 之間，變化不明顯；RIN 值在 7.10 ～ 10.00 之間，其中，48 h 血液 RNA 完整性與 0 h 比較具有統(tǒng)計學差異（P＜ 0.05）。圖 2 所示為血液樣本在常溫放置不同時間后對 RNA 影響的電泳圖，顯示隨著放置時間的延長，24 h 時電泳圖有雜帶出現(xiàn)，說明RNA 存在降解現(xiàn)象，尤其是 48 h 組降解明顯。以上結(jié)果表明，血液樣本常溫放置 48 h 對 RNA 的濃度和純度沒有顯著性影響，但是對 RNA 的完整性有影響。

2.3 冰上反復凍融對 RNA 質(zhì)量的影響

結(jié)果如表 3 所示，提取的 RNA 樣本經(jīng)反復凍融1 次、11 次、26 次和 41 次后，RNA 濃度范圍在 411.37～ 467.03 ng/μl 之間，隨著凍融次數(shù)增多，出現(xiàn)明顯下降趨勢，但是各組并沒有統(tǒng)計學差異；RNA 純度OD260/OD280值在 2.02 ～ 2.04 之間，變化不明顯；RIN 值維持在 9.70 ～9.93 之間并且各組無統(tǒng)計學差異。圖 3 所示為組織 RNA在冰上凍融相應(yīng)次數(shù)后的 RNA 電泳圖，結(jié)果顯示隨著組織RNA 在冰上凍融次數(shù)增加，未出現(xiàn)雜帶，說明 RNA 在本實驗中沒有發(fā)生明顯的降解。以上結(jié)果表明，保存在 –80 ℃冰箱中的 RNA，在冰上反復凍融后對 RNA 的濃度有一定影響，對 RNA 的純度和完整性沒有明顯的影響。

圖 1 血液樣本 4 ℃ 不同放置時間對 RNA 影響電泳圖（A、B、C 代表 3 例血液樣本）

表 2 血液樣本常溫下不同放置時間對 RNA 濃度、純度及完整性影響

表 3 組織 RNA 冰上反復凍融對 RNA 濃度、純度及完整性影響

圖 2 血液樣本常溫下不同放置時間對 RNA 影響電泳圖（A、B、C 代表 3 例血液樣本）

圖 3 組織 RNA 冰上反復凍融對 RNA 影響電泳圖（A、B、C 代表 3 例組織樣本）

3 討論

血液和組織是臨床檢測、科學研究和生物樣本庫存儲的主要素材，其中 RNA 是研究基因表達和翻譯的最常用材料，因此，RNA 的質(zhì)量對保證科學研究的準確性具有重要意義。RNA 樣本的質(zhì)量檢測包括濃度、純度、完整性以及RT-PCR 反應(yīng)擴增率等[9]。完整性和均一性是評價 RNA 質(zhì)量的兩個最關(guān)鍵標準[10-13]。

由于 RNA 極其容易降解，影響其質(zhì)量的因素眾多，血液樣本存儲溫度和時間是影響 RNA 質(zhì)量的重要因素。何松哲等[6]將血液標本置于 4 ℃ 條件下，每隔 1、3、5、7 天提取 RNA，結(jié)果顯示存儲溫度和時間對 RNA 純度有明顯影響。吳苗等[7]將外周血細胞置于 4 ℃ 保存，每隔 1、3、10 天提取 RNA，結(jié)果顯示 RNA 能穩(wěn)定保存長達 10 d 且不被降解，同樣的我們研究發(fā)現(xiàn)血液樣本在 4 ℃ 條件下放置 1 周，RNA 濃度和純度均與 0 h 沒有統(tǒng)計學差異，說明該條件下不會影響 RNA 的濃度和純度。RNA 完整性檢測發(fā)現(xiàn)，血液樣本在 4 ℃ 放置 1 周，RIN 值與 0 h 比較具有統(tǒng)計學差異。另外，通過生物分析儀檢測發(fā)現(xiàn)，血液樣本在 4 ℃ 放置 1 周電泳圖出現(xiàn)明顯的雜帶，說明 RNA存在降解現(xiàn)象。同時，我們還發(fā)現(xiàn)血液樣本在常溫放置 48 h與在 4 ℃ 條件下放置 1 周結(jié)果一致。究其原因，血液樣本在離體后立即提取 RNA 可保證 RNA 的質(zhì)量，但是隨著放置時間的延長，RNA 因其化學結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定以及內(nèi)源性、外源性 RNA 酶的酶解作用導致其含量下降，全血中的紅細胞會發(fā)生裂解，其釋放的蛋白同樣也會影響總 RNA 純化[14]，有可能導致 RNA 完整性下降。在本研究中，血液樣本在 4 ℃ 放置 1 周和常溫放置 48 h 時出現(xiàn)降解，但是OD260/OD280比值并未發(fā)生明顯變化，而 RIN 值出現(xiàn)顯著性差異，說明使用生物分析儀檢測 RIN 值是評估 RNA 質(zhì)量更為敏感的指標。綜上所述，為了獲得完整性好、質(zhì)量高的 RNA，采集后的血液樣本應(yīng)及時放入 4 ℃ 冰箱中或在24 h 內(nèi)及時處理。

新鮮冰凍的組織也是常用的生物樣本，但由于成分復雜，組織樣品在解凍后的幾分鐘甚至幾秒鐘就啟動 RNA 降解程序[15]，導致 RNA 的濃度和純度降低。另外，在實際的臨床檢測和科學研究過程中，存在對某一樣品 RNA 重復檢測的需求，因此，探討 RNA 反復凍融對 RNA 質(zhì)量的影響具有現(xiàn)實意義。目前，有關(guān) RNA 反復凍融對 RNA 的濃度、純度及完整性影響的研究鮮有報道。本研究完全模擬日常實驗，將 RNA 凍融多次（1 次、11 次、26 次和41 次），結(jié)果顯示隨著凍融次數(shù)的增多，RNA 濃度均值出現(xiàn)下降趨勢，但是各組并沒有統(tǒng)計學差異，可認為反復凍融對 RNA 濃度無影響；RIN 值始終維持在 9.70 ～ 9.90 之間，電泳圖也未見雜帶出現(xiàn)，提示 RNA 未降解，完整性未受凍融的影響。出現(xiàn)上述結(jié)果的原因我們認為 RNA 濃度也是影響 RNA 穩(wěn)定性和質(zhì)量的因素，本研究中濃度較高（＞ 400 ng/μl）的 RNA 反復凍融后即使存在 RNA 降解，高 RNA 濃度也可能會掩蓋 RNA 的降解。但是 RNA 反復凍融對低濃度 RNA 質(zhì)量的影響尚缺乏相關(guān)研究，課題組后續(xù)會設(shè)計系列實驗加以證實。本研究說明在較高濃度條件下，保存在 –80 ℃ 冰箱中的 RNA 反復凍融后對 RNA 的濃度有一定影響，但對 RNA 的純度和完整性影響不大。

本研究結(jié)果顯示血液樣本在 4 ℃ 條件下放置 1 周和常溫放置 48 h，不會對 RNA 濃度和純度造成明顯影響，但是會造成 RNA 降解，影響 RNA 的完整性；較高濃度的 RNA 反復凍融會降低 RNA 的濃度，但是不會影響RNA 的純度和 RNA 完整性。提示我們在臨床檢測、科學研究和樣本存儲時，血液樣本在 4 ℃ 放置不要超過 72 h，在常溫放置不要超過 24 h。在常規(guī)實驗中，高濃度 RNA 的反復凍融不會影響 RNA 質(zhì)量。