宋楊，楊珺

作者單位：610021 成都，信息產(chǎn)業(yè)電子第十一設(shè)計(jì)研究院科技工程股份有限公司（宋楊）；200333 上海賽傲生物技術(shù)有限公司（楊珺）

干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，由于其具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學(xué)界稱為“萬用細(xì)胞”。1963 年，Ernest 和 James 首次在血液中發(fā)現(xiàn)了一類具有分化為血液組分細(xì)胞的祖細(xì)胞，并將這一類細(xì)胞命名為多能干細(xì)胞，成為人類歷史上第一次被發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞。1967 年，Thomas 使用造血干細(xì)胞，對白血病患者成功進(jìn)行了干細(xì)胞移植，并于 1990 年獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。至20 世紀(jì) 80 年代，臨床中開始廣泛利用干細(xì)胞進(jìn)行多種疾病的治療。1998 年，美國 FDA 公布了《人體細(xì)胞療法與基因治療指南》，成為全球首個細(xì)胞治療的管理規(guī)范，干細(xì)胞運(yùn)用開始正式走向規(guī)范化管理。

目前，我國在干細(xì)胞研究和臨床應(yīng)用上尚處于發(fā)展初期，國家對于干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)的規(guī)范化引導(dǎo)和管理一直十分重視。1999 年，衛(wèi)生部頒布《臍帶血造血干細(xì)胞庫管理辦法》，對臍帶血造血干細(xì)胞存儲開始進(jìn)行規(guī)范化管理。2003 年，CFDA 公布《人體細(xì)胞治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》，標(biāo)志著我國對治療用細(xì)胞的研究和制備的質(zhì)量控制在制度層面開始形成。2016 年，中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會發(fā)布《干細(xì)胞制劑制備質(zhì)量管理自律規(guī)范》，在干細(xì)胞制備、存儲和檢測等過程中確立了有效、可參照的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

本文基于《干細(xì)胞制劑制備質(zhì)量管理自律規(guī)范》和細(xì)胞制劑的生產(chǎn)工藝特點(diǎn)，結(jié)合工程設(shè)計(jì)實(shí)踐，對干細(xì)胞制劑車間的設(shè)計(jì)要點(diǎn)進(jìn)行闡述，為該類項(xiàng)目的工程設(shè)計(jì)工作提供參考。

1 干細(xì)胞制劑的生產(chǎn)工藝流程

干細(xì)胞制劑的標(biāo)準(zhǔn)操作流程包括原材料的采集、運(yùn)輸、接收，干細(xì)胞的培養(yǎng)、檢測與質(zhì)控、存儲、復(fù)蘇，不合格產(chǎn)品的處理等。工藝流程見圖 1。

1.1 原材料的采集

干細(xì)胞原材料的采集來源一般為人體組織或血液，應(yīng)當(dāng)在具有醫(yī)療執(zhí)業(yè)許可資質(zhì)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)的潔凈環(huán)境中進(jìn)行采集。采集過程應(yīng)當(dāng)首先確認(rèn)供體來源的安全性，需進(jìn)行外源性致病因子的篩查，尤其是 HBV、HCV、HIV、EBV、CMV以及梅毒螺旋體等急性傳染病因子的確認(rèn)。采集所得的組織或血液應(yīng)迅速存入組織保存液或抗凝管中，防止外界污染或血液凝集。

1.2 原材料的運(yùn)輸

原材料運(yùn)輸中應(yīng)當(dāng)注意溫度和時間的控制，應(yīng)采用恒溫保存箱進(jìn)行封閉運(yùn)輸，恒溫保存箱中應(yīng)進(jìn)行溫度控制，避免因溫度急劇上升而導(dǎo)致組織失效、失活或變性；由于組織離開人體后存在存活時限，應(yīng)當(dāng)盡快運(yùn)送至制備場所，防止因運(yùn)輸時間過久而導(dǎo)致組織活性喪失。

圖 1 干細(xì)胞制劑的工藝流程圖

1.3 原材料的接收

原材料抵達(dá)制備場所后，接收部門應(yīng)當(dāng)確認(rèn)運(yùn)載器皿的外觀是否存在破損、泄漏等異常，同時，核對干細(xì)胞來源相關(guān)信息，比如母體健康狀況、臍血的傳染病因子檢測結(jié)果和來源一致性，合格后進(jìn)入生產(chǎn)制備過程。

1.4 干細(xì)胞的培養(yǎng)制備

干細(xì)胞分離和培養(yǎng)過程應(yīng)在潔凈環(huán)境中進(jìn)行，其潔凈要求應(yīng)為 B 級背景下的局部 A 級。培養(yǎng)操作人員應(yīng)當(dāng)注意進(jìn)出潔凈室的相關(guān)規(guī)定。

以酶消化法為例，干細(xì)胞分離時，首先用滅菌后的手術(shù)剪或手術(shù)刀將組織來源切割為小組織塊，放入離心管或培養(yǎng)瓶中，加入胰酶、膠原酶或分散酶的一種或幾種，將組織消化為單個細(xì)胞或細(xì)小的細(xì)胞團(tuán)，消化至細(xì)胞形態(tài)趨于圓球狀時，于容器中加入 FBS 胎牛血清終止消化，并以 PBS 緩沖液清洗，清洗完畢后，加入干細(xì)胞培養(yǎng)基，吹散混勻，放入 CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.5 干細(xì)胞的檢測和質(zhì)量控制

在工藝的每個關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)中，應(yīng)對干細(xì)胞的安全性、生物特性等指標(biāo)進(jìn)行檢測和控制。安全性指標(biāo)主要包括無菌、支原體和內(nèi)毒素的檢查；生物特性包括細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞活率和細(xì)胞表型的檢測。對于符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞進(jìn)行批次放行，不符合的進(jìn)行廢棄處理。

1.6 干細(xì)胞的儲存

對于需要長期存儲的干細(xì)胞，應(yīng)當(dāng)在干細(xì)胞分離后以凍存保護(hù)液進(jìn)行重懸，控制細(xì)胞密度為（1 ～ 5）× 107個/ml，并在 –150 ℃ 的氣氮罐中或 –196 ℃ 的液氮罐中進(jìn)行長期凍存。

圖 2 干細(xì)胞制劑車間工藝平面圖

1.7 干細(xì)胞的復(fù)蘇

如申請使用儲存的干細(xì)胞，干細(xì)胞樣本應(yīng)快速復(fù)蘇解凍并對冷凍外包裝消毒后再取樣檢測，合格的干細(xì)胞經(jīng)過包裝后送至醫(yī)療場所用于臨床治療。

1.8 不合格產(chǎn)品的處理

干細(xì)胞制備過程中，如發(fā)現(xiàn)不符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的過程培養(yǎng)物或最終制劑，應(yīng)當(dāng)按照不合格品進(jìn)行處理，由于干細(xì)胞制品本身的特點(diǎn)，所有過程不合格培養(yǎng)物或不合格產(chǎn)品應(yīng)按照醫(yī)療廢物的處理原則進(jìn)行處置，采用 121 ℃ 高溫高壓的方式進(jìn)行滅菌處理，再由相關(guān)專業(yè)處理機(jī)構(gòu)進(jìn)行集中銷毀。

2 干細(xì)胞制劑的生產(chǎn)車間設(shè)計(jì)分析

2.1 車間選址和外環(huán)境設(shè)計(jì)

干細(xì)胞制劑車間應(yīng)建立在自然環(huán)境良好的區(qū)域，應(yīng)遠(yuǎn)離空氣嚴(yán)重污染、水質(zhì)嚴(yán)重污染或病原微生物（含未知或無檢測手段的病原微生物）豐富的場所，應(yīng)遠(yuǎn)離振動或噪聲干擾的區(qū)域；如果車間有細(xì)胞儲存功能，則應(yīng)進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險評估，不應(yīng)設(shè)在地震斷裂帶或者地質(zhì)災(zāi)害活躍區(qū)域。

干細(xì)胞制劑車間周圍應(yīng)綠化；車間所在廠區(qū)內(nèi)盡量減少露土面積，不應(yīng)種植易散發(fā)花粉或?qū)λ幤飞a(chǎn)產(chǎn)生不良影響的植物；車間應(yīng)建立并實(shí)施防蟲、防鼠、防花粉等措施，防止無關(guān)動物進(jìn)入控制區(qū)域。

2.2 車間內(nèi)環(huán)境設(shè)計(jì)

圖 2 是干細(xì)胞制劑車間的工藝平面圖，本文將以其為例進(jìn)行設(shè)計(jì)要點(diǎn)的闡述。

2.2.1 工藝平面分析 干細(xì)胞制劑有規(guī)模小且多批次同時進(jìn)行的特點(diǎn)，為了防止污染和交叉污染應(yīng)保持人流、物流分開，潔凈物品和污染物分開。

本案例按照功能分為兩個部分，一個部分是清洗準(zhǔn)備區(qū)（D 級背景），一個部分是制劑生產(chǎn)區(qū)（B 級背景）。這兩個區(qū)域的人流、物流完全獨(dú)立，不存在交叉污染的風(fēng)險。

對于清洗準(zhǔn)備區(qū)：人員從東北角通過換鞋間（換鞋、洗手）、更潔凈服間（穿潔凈服）進(jìn)入 D級走道，再進(jìn)入各自的操作間，操作完成后退出到 D 級走道，在更潔凈服間脫掉潔凈服后通過換鞋間退出。物品從西北角在拆外包間拆包后在緩沖間自凈，再由 D 級區(qū)的操作人員將物品拿到 D級區(qū)域進(jìn)行分發(fā)、清洗、滅菌等操作，廢棄物待操作結(jié)束后由緩沖間、拆外包間退出。

對于 B 級制劑生產(chǎn)區(qū)，人員從東北角通過換鞋間（換鞋、洗手）后男女分開更衣，逐個通過穿無菌內(nèi)衣間后，進(jìn)入穿無菌外衣間，然后進(jìn)入 B 級前走道，再進(jìn)入各自的操作間，操作完成后退出 C 級后走道，通過各自的脫衣間脫掉無菌服后退出車間，脫掉的無菌服通過緩沖間的傳遞窗進(jìn)入洗衣間進(jìn)行清洗、整理，再經(jīng)滅菌后回到 B 級更衣間。進(jìn)入 B 級的物品（采集物除外）均需要滅菌后進(jìn)入潔凈物品存放間，然后再由人員分發(fā)到各個操作間的傳遞窗，操作間的操作人員從傳遞窗中取出物品后進(jìn)行操作，操作結(jié)束后廢棄物由傳遞窗傳遞到后走道，再通過西南角的污物傳遞間消毒后退出車間。采集物在東側(cè)的接收間確認(rèn)采集物外表完好、數(shù)據(jù)完整后進(jìn)入消毒間進(jìn)行外表面的消毒，再通過傳遞窗進(jìn)入 B 級前走道，再分發(fā)到操作間，操作完成后制劑通過傳遞窗傳遞到 C 級后走道，再經(jīng)過傳遞窗進(jìn)入程序降溫間降溫后去存儲。

經(jīng)以上分析可見，本案例的人流、物料流、制品流均從不同的方向和獨(dú)立的設(shè)施進(jìn)入車間，在車間內(nèi)也是單向流動，做到盡可能地降低人員和物料的交叉污染和混淆的風(fēng)險。

2.2.2 空調(diào)凈化分析 干細(xì)胞制劑屬于無菌制劑，但是不同于傳統(tǒng)的無菌制劑，干細(xì)胞制劑全過程無法進(jìn)行除菌過濾，且非完全密封狀態(tài)下的細(xì)胞操作多，因此干細(xì)胞制劑的生產(chǎn)應(yīng)在 B 級背景下的 A 級環(huán)境中進(jìn)行。本案例中開敞的細(xì)胞（如分離、培養(yǎng)、灌裝等）操作均在 B 級背景下的A2 級生物安全柜中進(jìn)行，生物安全柜既能提供 A 級的垂直氣流保護(hù)制品，又能提供相對負(fù)壓保證操作人員的安全。干細(xì)胞制劑有多批次同時進(jìn)行的特點(diǎn)，B 級操作間（如樣本處理間、細(xì)胞培養(yǎng)間等）需要全排風(fēng)，這樣才能控制不同批次之間發(fā)生交叉污染的風(fēng)險。然而后走道由于沒有暴露操作，根據(jù)《干細(xì)胞制劑制備質(zhì)量管理自律規(guī)范》的要求，背景環(huán)境設(shè)計(jì)為 C 級[1]。清洗準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行器具的最終清洗、包裝、滅菌，根據(jù)《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求，該區(qū)域的背景環(huán)境設(shè)計(jì)為 D 級[2]。

表 1 是《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》附錄 1 無菌藥品要求的各級別空氣懸浮粒子的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定[2]。在關(guān)鍵操作的全過程（如樣本處理間、細(xì)胞培養(yǎng)間等）中，設(shè)計(jì)懸浮粒子監(jiān)測。當(dāng) A 級和 B 級潔凈區(qū)，連續(xù)或有規(guī)律地出現(xiàn)少量 ≥ 5.0 μm的懸浮粒子時，需要進(jìn)行調(diào)查。生產(chǎn)操作全部結(jié)束、操作人員撤出生產(chǎn)現(xiàn)場并經(jīng) 15 ～ 20 min（指導(dǎo)值）自凈后，潔凈區(qū)的懸浮粒子應(yīng)當(dāng)達(dá)到表中的靜態(tài)標(biāo)準(zhǔn)。

表 1 各級別懸浮粒子的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定

表 2 各級別微生物監(jiān)測的動態(tài)標(biāo)準(zhǔn)

表 2 是《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》附錄 1 無菌藥品要求的各個級別微生物監(jiān)測的動態(tài)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定[2]。對潔凈區(qū)的微生物進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，評估無菌生產(chǎn)的微生物狀況。監(jiān)測方法有沉降菌法、定量空氣浮游菌采樣法和表面取樣法（如棉簽擦拭法和接觸碟法）等。動態(tài)取樣應(yīng)當(dāng)避免對潔凈區(qū)造成不良影響。成品批記錄的審核應(yīng)當(dāng)包括環(huán)境監(jiān)測的結(jié)果。對表面和操作人員的監(jiān)測，應(yīng)當(dāng)在關(guān)鍵操作完成后進(jìn)行。在正常的生產(chǎn)操作監(jiān)測外，可在系統(tǒng)驗(yàn)證、清潔或消毒等操作完成后增加微生物監(jiān)測。

表 3 是《廠房設(shè)施與設(shè)備》[3]對于潔凈區(qū)的溫度和相對濕度的建議值。保持潔凈室的溫度和相對濕度通常只是為了使操作人員感到舒適，但這是必須的，因?yàn)樵跐崈魠^(qū)內(nèi)人員是最大的污染源，如人員不適，會釋放大量的粒子和微生物，對潔凈區(qū)造成污染。

2.2.3 電氣系統(tǒng)分析 根據(jù)臨床細(xì)胞治療技術(shù)平臺設(shè)置基本要求[4]，重要的公用工程設(shè)備和關(guān)鍵的工藝設(shè)備需按照2 級負(fù)荷供電。生物安全柜、培養(yǎng)箱等關(guān)鍵設(shè)備均配備 UPS電源，供電時間不少于 30 min。生物安全柜排風(fēng)管的風(fēng)機(jī)也需要配備應(yīng)急電源，目的是在斷電的情況下生物安全柜內(nèi)可以保持負(fù)壓，以免污染產(chǎn)品和污染操作人員。制劑車間需要設(shè)置視頻監(jiān)控系統(tǒng)、入侵報警系統(tǒng)、門禁系統(tǒng)、消防系統(tǒng)和數(shù)據(jù)可追溯系統(tǒng)等。這些措施是為了保證干細(xì)胞制劑車間的安全性、有效性和可追溯性。

為了防止制劑車間內(nèi) CO2培養(yǎng)箱 CO2泄漏導(dǎo)致人員窒息的事故發(fā)生，需要對使用點(diǎn)進(jìn)行氣體濃度的探測并設(shè)計(jì)聲光報警裝置。

2.2.4 給排水系統(tǒng)分析 干細(xì)胞制劑車間的 B 級區(qū)域不需要工藝用給水和排水管道，目的是避免污染制品和潔凈區(qū)。在 D 級區(qū)的給水管道需設(shè)計(jì)防止回流的裝置（如止回閥或者空氣隔斷裝置），排水管道均設(shè)計(jì)存水彎和液封，在存水彎處定期添加消毒液保證排水達(dá)標(biāo)。

2.2.5 建筑裝修分析 建筑裝修選材需不產(chǎn)塵、不積塵、防潮、易清洗、耐腐蝕和符合防火規(guī)范的要求，潔凈室的門需要加裝閉門器，插座、開關(guān)、燈具等需選擇嵌入式的設(shè)計(jì)和安裝。

表 3 潔凈區(qū)的溫度和相對濕度的建議值

3 結(jié)論

干細(xì)胞制劑車間的設(shè)計(jì)需要保證制劑的安全性、數(shù)據(jù)的有效性和可追溯性，同時應(yīng)嚴(yán)格按照國家相關(guān)的政策法規(guī)執(zhí)行。但是制劑車間 B 級的凈化面積較大，降低空調(diào)系統(tǒng)的能耗、降低車間的運(yùn)營成本將是今后比較大的挑戰(zhàn)，需要在以后的工程中重點(diǎn)控制。