邢楊，葉飛，楊琳，張維，蘇希鵬，劉冰冰

作者單位：100067 北京市安全生產(chǎn)科學(xué)技術(shù)研究院職業(yè)衛(wèi)生研究中心

人類免疫缺損病毒（human immunodeficiency virus，HIV）通過(guò)入侵人類免疫系統(tǒng)，破壞防御體系，殺死免疫系統(tǒng)細(xì)胞，致使被感染者患上獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）。自 1981 年艾滋病被首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)[1]，其傳播速度越來(lái)越快、傳播范圍越來(lái)越廣。2017 年聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署（The Joint United Nations Programme on HIV and AIDS，UNAIDS）統(tǒng)計(jì)顯示，全世界范圍內(nèi)艾滋病患者已達(dá) 3700 萬(wàn)人，其中接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者達(dá) 2100 萬(wàn)人，新增艾滋病患者達(dá) 180 萬(wàn)人[2]。由于 10% ～ 60% 的艾滋病病毒感染者在初期并未顯現(xiàn)任何癥狀，大部分病毒攜帶者并未意識(shí)到已感染艾滋病病毒。美國(guó)疾病預(yù)防工作小組針對(duì)此問(wèn)題建議對(duì)艾滋病病毒攜帶者及感染者進(jìn)行全面篩查，其中包括青年人、老年人及孕婦[3]，進(jìn)而降低病毒擴(kuò)散速度，盡早防范艾滋病的傳播。

HIV 在體內(nèi)復(fù)制包括感染、逆轉(zhuǎn)錄、整合、轉(zhuǎn)錄和包裝五個(gè)過(guò)程。首先，HIV 與宿主輔助性 T 細(xì)胞表面融合并進(jìn)入細(xì)胞，破裂釋放 2 個(gè)核糖核酸（RNA）和 3 種酶（逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶）；HIV 通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶將其 RNA信息復(fù)制到 DNA；整合酶將病毒雙鏈 DNA 整合至宿主細(xì)胞染色體的 DNA 鏈中，形成前病毒基因，并通過(guò)宿主RNA 聚合酶形成一條新的 RNA 鏈。HIV 感染過(guò)程所需的3 種酶中，HIV-1 整合酶對(duì)病毒 DNA 整合到宿主細(xì)胞DNA 起重要作用。研發(fā)整合酶抑制劑成為治療艾滋病及抑制病毒傳播的重要方法。近年來(lái)陸續(xù)有研究表明整合酶抑制劑對(duì)治療艾滋病有較好作用。別構(gòu)抑制劑是通過(guò)改變酶分子構(gòu)象起到抑制酶活的作用。通過(guò)總結(jié)基于別構(gòu)調(diào)節(jié)機(jī)制的HIV-1 整合酶抑制劑研究進(jìn)展，將有助于新型整合酶抑制劑的開發(fā)及艾滋病職業(yè)暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究。

根據(jù) HIV-1 整合酶的作用可開發(fā)防御 HIV-1 藥物。在過(guò)去的 20 年中，已發(fā)現(xiàn)許多 HIV-1 整合酶抑制劑[4-5]。長(zhǎng)期服用一類藥物，病毒易產(chǎn)生交叉耐藥性，亟需開發(fā)新型化學(xué)療法來(lái)抑制病毒對(duì)人體的侵襲。1996 年，美籍華裔科學(xué)家何大一提出高效抗逆轉(zhuǎn)錄治療方法。該方法通過(guò)聯(lián)合使用3 種或 3 種以上的抗病毒藥物來(lái)達(dá)到治療艾滋病的目的。它彌補(bǔ)了單一用藥產(chǎn)生的抗藥性的缺點(diǎn)，可最大限度抑制病毒復(fù)制，從而部分甚至全部恢復(fù)機(jī)體免疫功能，延緩病程，延長(zhǎng)患者生命，提高生活質(zhì)量[6]。2010 年，Nature刊登了一篇關(guān)于 DNA 鏈轉(zhuǎn)移抑制機(jī)制的文章，它揭示了 HIV-1整合酶在艾滋病病毒復(fù)制整合的作用過(guò)程[7]。2012 年，Bojja等[8]研究了 HIV-1 整合酶多聚體的分子聚合形態(tài)，對(duì)后續(xù)開發(fā)新型整合酶抑制劑具有重要意義。整合酶結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了整合酶分子別構(gòu)調(diào)節(jié)機(jī)制的研究。近年來(lái)，關(guān)于整合酶多聚體的定向轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)及別構(gòu)抑制劑的研發(fā)受到研究者的廣泛關(guān)注。本文對(duì)近年來(lái)關(guān)于 HIV-1 整合酶結(jié)構(gòu)及基于別構(gòu)調(diào)節(jié)機(jī)制的 HIV-1 整合酶抑制劑研究情況進(jìn)行總結(jié)。

1 HIV-1 整合酶結(jié)構(gòu)

HIV-1 整合酶蛋白質(zhì)分子量為 32 kD，其蛋白質(zhì)分子鏈分為三個(gè)區(qū)域，即 N 端結(jié)構(gòu)域（NTD）、核心結(jié)構(gòu)域（CCD）和 C 端結(jié)構(gòu)域（CTD）。HIV-1 整合酶分子存在多種聚合形式，有二聚體分子、四聚體分子、八聚體分子和高聚體分子。整合酶的三個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)Χ嗑垠w的形成及 DNA 對(duì)整合酶吸附具有重要作用。一般來(lái)說(shuō)，重組蛋白溶解性較差，很難獲取原子水平的重組蛋白結(jié)構(gòu)的相關(guān)信息。研究者們通過(guò)選取蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中的單一區(qū)域或兩個(gè)區(qū)域進(jìn)行研究。2010 年科學(xué)家通過(guò)解析吸附在 DNA 鏈端的原型泡沫病毒整合酶結(jié)構(gòu)來(lái)研究 HIV-1 整合酶分子結(jié)構(gòu)[7]。研究發(fā)現(xiàn)HIV-1 整合酶多聚體分子中起催化整合作用的主要是四聚體分子。研究發(fā)現(xiàn)整合酶四聚體分子是通過(guò)兩個(gè)整合酶二聚體分子聚合而成。此發(fā)現(xiàn)為開發(fā)別構(gòu)調(diào)節(jié)抑制劑提供理論依據(jù)[8]。

研究酶的活性位點(diǎn)是進(jìn)行生物酶動(dòng)力學(xué)研究的第一步。HIV-1 整合酶分子中存在多類活性位點(diǎn)，如：鏈轉(zhuǎn)移和3'-加工端反應(yīng)的活性位點(diǎn)，影響因子 LEDGF/p75 及鏈轉(zhuǎn)移抑制物結(jié)合的位點(diǎn)。此外，研究者們發(fā)現(xiàn)整合酶存在可供不同小分子吸附的結(jié)合位點(diǎn)。Wielens 等[9]發(fā)現(xiàn)一類小分子的結(jié)合位點(diǎn)，此位點(diǎn)包含殘基 Tyr83、Try108、Asn184、Ile200和 Val201。Wielens 等[10]發(fā)現(xiàn)可吸附蔗糖分子的活性位點(diǎn)，殘基包含 Asp64、Asp116、Asn144、Gln146、Gln148 和Glu153。

2 HIV-1 整合酶催化機(jī)制

HIV-1 整合酶將 HIV 的基因整合到宿主細(xì)胞 DNA鏈上，主要發(fā)生兩類親核反應(yīng)：3'-終端過(guò)程和鏈轉(zhuǎn)移過(guò)程[11]。不同的反應(yīng)過(guò)程中，HIV-1 整合酶分子結(jié)構(gòu)多聚體形態(tài)發(fā)生變化。3'-終端反應(yīng)過(guò)程發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，兩個(gè)二聚體整合酶分子分別吸附在病毒雙螺旋 DNA 分子鏈的 3'-端，催化脫除 2 個(gè)二核苷酸分子，使活性基團(tuán)羥基暴露出來(lái)，形成預(yù)整合混合物。鏈轉(zhuǎn)移過(guò)程發(fā)生在細(xì)胞核中，吸附在病毒DNA 鏈兩端的整合酶二聚體分子相互聚攏，形成一個(gè)新的四聚體整合酶分子。在 LEDGF/p75 作用下，整合酶切斷目標(biāo) DNA 鏈，催化病毒 DNA 整合到宿主 DNA 鏈上。最后，通過(guò)宿主蛋白酶修復(fù) DNA 鏈的連接端并完成 DNA序列復(fù)制，形成一條含有病毒 DNA 的分子鏈。在病毒基因復(fù)制過(guò)程中，整合酶的多聚體形態(tài)變化起到了重要作用。因此，可以通過(guò)干預(yù)整合酶多聚體構(gòu)象變化，添加某種抑制劑定向轉(zhuǎn)化多聚體，從而達(dá)到抑制整合酶催化作用。

圖 1 可能存在的整合酶結(jié)合形式（白點(diǎn)代表核心結(jié)構(gòu)域上的活性位點(diǎn)）

3 別構(gòu)調(diào)節(jié)劑

3.1 多聚體的形成

游離在溶液中的整合酶分子存在二聚體與四聚體相互轉(zhuǎn)化的動(dòng)態(tài)平衡[12]。整合酶的聚合形式因分子濃度變化而變化。100 ～ 200 nmol/L 濃度下，游離狀態(tài)的整合酶主要以四聚體形式存在于溶液當(dāng)中。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度高于 250 nmol/L時(shí)，整合酶分子易發(fā)生絮凝[13]。四聚體整合酶-DNA 混合物的形成條件是 DNA 兩端的二聚體整合酶分子相互聚攏，而游離的四聚體并不會(huì)吸附在病毒 DNA 鏈的兩端[14]?？梢?，病毒 DNA 兩端吸附二聚體整合酶對(duì) 3'-端過(guò)程反應(yīng)起重要作用，而 DNA 兩端吸附的四聚體對(duì)隨后的整合過(guò)程至關(guān)重要[15]。病毒 DNA 長(zhǎng)末端重復(fù)序列可誘導(dǎo)病毒 DNA分子與二聚體整合酶的吸附。由于 DNA 主要與二聚體相互作用，在二聚體與四聚體動(dòng)態(tài)平衡中，DNA 的存在會(huì)使體系中二聚體含量升高。HIV-1 整合酶從多聚體轉(zhuǎn)化成為二聚體，同時(shí)伴有 DNA 的吸附反應(yīng)。

鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)需要影響因子 LEDGF/p75 的參與，它可激活體內(nèi)或體外細(xì)胞中吸附在 DNA 兩端的整合酶形成四聚體，并綁定其共同進(jìn)入宿主的染色體內(nèi)。研究如何抑制鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)或整合酶的聚合的過(guò)程成為開發(fā)新藥物的主要途徑。介于 LEDGF/p75 對(duì)病毒入侵人體細(xì)胞的重要作用，IN-LEDGF/p75 也成為開發(fā)新型抗 HIV-1 藥物的研究熱點(diǎn)。LEDGF/p75 分子結(jié)構(gòu)包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即 N-terminal Pro-Trp-Trp-Pro 結(jié)構(gòu)域（PWWP）和整合酶吸附結(jié)構(gòu)域（intergrase-binding domine，IBD）[16]。其中，IBD 結(jié)構(gòu)域可促進(jìn) LEDGF/p75 與整合酶的吸附。

3.2 酶分子聚合形式

蛋白質(zhì)基本結(jié)構(gòu)單元間的連接方式有以下幾種：結(jié)構(gòu)域交換、非共價(jià)和共價(jià)連接。Bojja 等[8]發(fā)現(xiàn) HIV-1 整合酶存在兩類二聚體的結(jié)合形式，延伸二聚體和核心區(qū)結(jié)合二聚體。延伸二聚體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性主要靠分子的兩個(gè)基本結(jié)構(gòu)單元的結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合形成，這種結(jié)合包含兩個(gè)方面，一方面是兩個(gè)基本結(jié)構(gòu)單元中的其中一個(gè)單元的 C 端結(jié)構(gòu)域、N 端結(jié)構(gòu)域與另一個(gè)單元的催化核心區(qū)域緊密結(jié)合，另一方面是兩個(gè)結(jié)構(gòu)單元的 C 端結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合（圖 1）。另一種結(jié)合叫核心區(qū)結(jié)合，主要是通過(guò)兩個(gè)結(jié)構(gòu)單元中核心結(jié)構(gòu)域的緊密貼靠穩(wěn)定分子結(jié)構(gòu)。以上所提到的單個(gè)結(jié)構(gòu)單元和二聚體的結(jié)合形式已在禽肉瘤病毒的單分子結(jié)構(gòu)和二聚體結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)并報(bào)道過(guò)。在原型泡沫病毒的結(jié)晶結(jié)構(gòu)中也曾發(fā)現(xiàn)過(guò)含有由核心結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合而形成的二聚體結(jié)構(gòu)。

整合酶四聚體分子結(jié)構(gòu)如圖 2 所示。由于 N 端結(jié)構(gòu)域與核心結(jié)構(gòu)域間的疏水作用，延伸二聚體存在區(qū)交換現(xiàn)象。為了獲得更大的疏水結(jié)構(gòu)區(qū)，N 端結(jié)構(gòu)域與其他二聚體的 N 端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成以核心域與核心域相互作用的四聚體酶分子（圖 2）。

酶是一類具有催化作用的蛋白質(zhì)分子，其四級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)的活性起重要作用。蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的穩(wěn)定性與其生物學(xué)活性息息相關(guān)，外界溫度和 pH 對(duì)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)影響也較大。別構(gòu)調(diào)節(jié)是指通過(guò)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化而抑制蛋白質(zhì)分子活性[17]?；诘鞍踪|(zhì)分子的這一特性研發(fā)的酶抑制劑叫作別構(gòu)調(diào)節(jié)劑[18]。關(guān)于別構(gòu)酶的催化動(dòng)力學(xué)模型主要有 MWC（Monod-Wyman-Changeux）、KNF（Koshland-Nemethy-Filmer）和 Morpheein 模型。其中，MWC 模型由 Monod 等[19]提出。此模型適用于酶分子結(jié)構(gòu)單元存在兩種構(gòu)象，同種構(gòu)象的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)單元可形成一個(gè)酶分子，并且兩種不同構(gòu)象的酶分子之間可以相互轉(zhuǎn)化，底物可吸附在任一種狀態(tài)的結(jié)構(gòu)單元上。KNF 模型適用條件：一個(gè)酶分子的結(jié)構(gòu)單元會(huì)在活性和非活性兩種狀態(tài)下轉(zhuǎn)變，即一個(gè)酶分子中可同時(shí)存在兩種狀態(tài)的結(jié)構(gòu)單元，且底物特異性地吸附在具有活性的結(jié)構(gòu)單元上。Morpheein 模型（圖 3）是研究異構(gòu)酶動(dòng)力學(xué)的重要模型之一，它描述了酶分子四級(jí)結(jié)構(gòu)異構(gòu)體相互轉(zhuǎn)化的情況[20]。如圖 3A 所示，酶的某種構(gòu)象的結(jié)構(gòu)單體可轉(zhuǎn)化成另一種構(gòu)象的結(jié)構(gòu)單體。不同的單體又可進(jìn)一步形成新的多聚體。反應(yīng)的底物即可吸附于單體，也可吸附于多聚體。利用 HIV-1 整合酶構(gòu)象變化研究新型抑制劑的研究方向受到廣泛關(guān)注[21]。已有研究表明 HIV-1 整合酶分子存在二聚體與四聚體的形式。通過(guò)調(diào)節(jié)整合酶多聚體平衡，定向促進(jìn)二聚體向四聚體轉(zhuǎn)化，進(jìn)而減弱游離的整合酶與 DNA 相互作用能力。此類機(jī)制下酶的動(dòng)力學(xué)研究可運(yùn)用 Morpheein 模型進(jìn)行分析[22]。

圖 2 二聚體與四聚體的結(jié)構(gòu)

圖 3 Morpheein 模型

3.3 多肽小分子類抑制劑

根據(jù) HIV-1 整合酶的催化特性，研究者們發(fā)現(xiàn)了一種可吸附于 HIV-1 整合酶四聚體上的多肽小分子[23-24]，這是首次發(fā)現(xiàn)可以利用小分子來(lái)調(diào)節(jié)整合酶核心催化域與影響因子間的相互作用，進(jìn)而抑制整合酶的催化活性。

有研究表明從 LEDGF 中截取的肽可以吸附在 HIV-1整合酶上，并抑制整合酶的活性。這類抑制物主要吸附在四聚體的核心域結(jié)合處，穩(wěn)定整合酶的四聚體結(jié)構(gòu)[25-26]。隨著抑制劑的加入，整合酶二聚體分子不斷轉(zhuǎn)化為四聚體分子。由于游離的整合酶四聚體分子是不能催化病毒 DNA 整合反應(yīng)，從而抑制病毒 DNA 對(duì)高活性的整合酶二聚體分子的吸附[27]。可見小分子肽也被叫作變構(gòu)抑制劑或轉(zhuǎn)換肽，可調(diào)節(jié)酶的活性狀態(tài)與非活性狀態(tài)間的轉(zhuǎn)換平衡。目前，大部分研究小分子肽吸附整合酶的過(guò)程主要采用 Hill 方程進(jìn)行分析。Morpheein 模型（圖 3B）也可用于整合酶的動(dòng)力學(xué)研究。相比于傳統(tǒng)的 Morpheein 模型，整合酶的Morpheein 模型是多聚體間的直接轉(zhuǎn)化，而不需要中間不同構(gòu)象單體的轉(zhuǎn)化。研究者們還從逆轉(zhuǎn)錄蛋白酶中成功提取小分子肽，并應(yīng)用于抑制整合酶的活性研究當(dāng)中。研究發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄蛋白中提取的小分子肽同樣可調(diào)節(jié)整合酶多聚體的動(dòng)態(tài)平衡，促進(jìn)整合酶的活性態(tài)向非活性態(tài)轉(zhuǎn)化。2017 年8 月，一份關(guān)于 peptide 的專利被成功授權(quán)，可成功分離peptide 并用于 HIV/AIDS 的治療[28]。

3.4 喹啉乙酸類抑制劑

Kessl 等[29]研究了兩種喹啉乙酸類物質(zhì)對(duì) HIV-1 整合酶與 LEDGF 相互作用的影響。研究發(fā)現(xiàn)此類物質(zhì)有助于整合酶多聚體的形成。喹啉乙酸類物質(zhì)濃度越高，越有利于形成整合酶多聚體。2016 年俄亥俄州立大學(xué)研究者們探討了含有吲哚結(jié)構(gòu)的整合酶抑制劑的作用[30]。他們采用骨架遷越方法合成一系列變構(gòu) HIV-1 整合酶抑制劑。結(jié)果表明這類物質(zhì)可以吸附在整合酶二聚體分子間的結(jié)合面，也是吸附 LEDGF/p75 的活性位點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)節(jié)整合酶的多態(tài)性，抑制整合酶活性。

4 展望

別構(gòu)抑制劑的添加實(shí)現(xiàn)了 HIV-1 整合酶蛋白質(zhì)分子定向轉(zhuǎn)化為四聚體，可有效抑制 DNA 與 HIV-1 整合酶的相互作用。別構(gòu)調(diào)節(jié)劑通過(guò)吸附 LEDGF 的結(jié)合位點(diǎn)或穩(wěn)定四聚體構(gòu)象，達(dá)到調(diào)節(jié) HIV-1 整合酶分子構(gòu)象，抑制整合過(guò)程的發(fā)生。繼續(xù)研究蛋白質(zhì)分子構(gòu)象對(duì)開發(fā)新型藥物具有重要的作用。目前絕大多數(shù)關(guān)于 HIV-1 整合酶的研究采用Hill 方程，此方法可推算出蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)單元數(shù)，但無(wú)法獲取蛋白質(zhì)在催化過(guò)程中的構(gòu)象變化的相關(guān)信息?；贖IV-1 整合酶的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，未來(lái)可采用 Morpheein 動(dòng)力學(xué)模型研究 HIV-1 整合酶動(dòng)力學(xué)及其構(gòu)象變化，篩選最佳治療艾滋病的藥物。