王濤，劉雁勇，楊楠，紀超，陳彪，左萍萍

28醇對MPTP致帕金森病模型小鼠行為學的作用及其機制①

王濤1，劉雁勇2，楊楠2，紀超2，陳彪1，左萍萍2

目的 觀察28醇對帕金森病模型小鼠行為學改善作用，并探討其可能的機制。方法75只成年雄性C57小鼠隨機分為5組：對照組，模型組，28醇低劑量組(25 mg/kg)、中劑量組(50 mg/kg)、高劑量組(100 mg/kg)，每組15只。除對照組外，其他各組間隔2 h腹腔注射MPTP 16 mg/kg共4次造模。28醇各劑量組按劑量連續(xù)灌胃給藥2周，其他組給予等量0.5%縮甲基纖維素鈉(CMC)無菌水。行為學檢測采用轉(zhuǎn)桿試驗和自發(fā)運動試驗，Nissl染色組化實驗檢測紋狀體神經(jīng)元數(shù)量及狀態(tài)，Western blot實驗檢測黑質(zhì)區(qū)p-Erk1/2、p-p38 MAPK、p-JNK表達。結(jié)果與對照組相比，28醇高劑量組轉(zhuǎn)桿試驗和自發(fā)運動試驗成績改善(P<0.05)。28醇中劑量和高劑量組含有Nissl小體的神經(jīng)元顯著增多并染色加深(P<0.05)，黑質(zhì)區(qū)p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表達與模型組相比下降(P<0.05)，p-Erk1/2表達與模型組無顯著性差異。結(jié)論28醇可改善帕金森病小鼠行為學指標。可能通過調(diào)節(jié)MAPKs家族信號轉(zhuǎn)導因子p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表達，減少黑質(zhì)紋狀體通路的損傷發(fā)揮其作用。

帕金森?。簧窠?jīng)保護；行為學；絲裂原活化蛋白激酶；28醇

帕金森病是常見的與衰老有關的神經(jīng)退行性疾病，其主要特征為黑質(zhì)紋狀體通路多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生變性壞死。目前臨床治療和開發(fā)中的抗帕金森病新藥主要包括以下7類[1]：多巴胺替代類藥、多巴胺受體激動劑、單胺氧化酶B抑制劑、兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)抑制劑、中樞性抗膽堿藥、谷氨酸受體拮抗劑(NMDA受體拮抗劑)、其他(腺苷A2a受體拮抗劑、α2腎上腺素能受體拮抗劑及神經(jīng)保護類藥物)。目前還沒有可靠的藥物能確切阻斷帕金森病的病程，大部分化學藥物長期使用效果不佳，且多具有較強毒副作用。28醇是一種從米糠蠟、甘蔗蠟等提取的天然長鏈高級脂肪醇，可有效降低血清膽固醇水平，抗脂質(zhì)過氧化，抑制血小板凝聚，抑制血管內(nèi)皮平滑肌細胞的增生等[2]。前期工作發(fā)現(xiàn)，28醇可以改善6-羥多巴胺致帕金森病模型大鼠的行為學指標，并具有神經(jīng)保護作用[3-4]。本研究擬在MPTP致帕金森病小鼠模型上進一步驗證28醇的行為學改善作用并探索絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族中的Erk1/2、p38 MAPK、JNK活化形式(磷酸化)是否參與其神經(jīng)保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康C57BL/6小鼠75只，雄性，由北京維通利化動物公司提供；體重20~25 g，行為測試無異常。隨機分為對照組(Sham control)、模型組(Model)、28醇低劑量組(Ocs-L,25 mg/kg·d)、28醇中劑量組(Ocs-M,50 mg/kg·d)、28醇高劑量組(Ocs-H,100 mg/kg·d)，每組15只。

1.2 主要試劑和藥品 28醇單體由中國醫(yī)學科學院藥物所朱海波教授惠贈，以含0.5%縮甲基纖維素鈉(CMC)無菌水助溶制成懸浮液；兔多克隆抗體p-p38 MAPK抗體、p-Erk1/2抗體和p-JNK抗體：美國CELL SIGNALING公司；兔多抗β-actin抗體：美國SANTA CRUZ公司；HRP標記羊抗兔二抗及SP-9002免疫組化試劑盒：北京中杉金橋公司；MPTP：美國SIGMA公司；轉(zhuǎn)桿實驗儀：北京吉日歐科技開發(fā)公司；自發(fā)運動監(jiān)測儀：中國醫(yī)學科學院藥物研究所。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型小鼠的制備[5]除對照組外，其他各組小鼠腹腔注射MPTP 16 mg/kg(0.5 ml/100 g)，共4次，每次間隔2 h。對照組注射等量生理鹽水。于造模后第2天，28醇治療組小鼠以25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg(0.1 ml/10 g)每天灌胃給藥1次，對照組和模型組給等量CMC無菌水，連續(xù)給藥2周。2周后開始行為學檢測。

1.3.2 行為學檢測

1.3.2.1 轉(zhuǎn)桿實驗 水平金屬桿(直徑3 cm)長約為50 cm，用金屬板分隔為5段，用擋板隔開動物彼此不受影響，轉(zhuǎn)速16 r/min。小鼠在轉(zhuǎn)桿上開始爬行后儀器自動記時，從轉(zhuǎn)桿跌落下來時可以被紅外裝置所監(jiān)測，自動停止記時并顯示小鼠在轉(zhuǎn)桿上運動的時間。如小鼠轉(zhuǎn)桿時間不足5 min，記錄實際時間；如超過5 min，記為5 min。初次學習5次后測定。

1.3.2.2 自發(fā)運動實驗 將小鼠置于自發(fā)運動監(jiān)測儀(圓形，直徑50 cm)中央部，保持環(huán)境安靜。自發(fā)運動監(jiān)測儀內(nèi)有多束紅外線穿過，動物活動時阻隔紅外線束，即可被檢測并記數(shù)。預適應2 min后，記錄小鼠5 min內(nèi)自發(fā)運動次數(shù)，包括直立運動和水平運動次數(shù)的總和。

1.3.3 紋狀體Nissl染色 行為學檢測后，每組取3只小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，剪開胸腔，暴露心臟，從左心尖處插入灌流針，剪開右心耳。先用PBS進行灌流，待血液沖洗干凈后改用4%多聚甲醛繼續(xù)灌流約15 min，斷頭取腦置4%多聚甲醛中4℃過夜。然后轉(zhuǎn)入15%、20%和30%蔗糖溶液中梯度脫水，4℃存放。冰凍切片機切取冠狀腦片，片厚12 μm，直接貼于多聚賴氨酸包被的玻璃片上，-20℃保存，用于組織化學檢測。選取紋狀體結(jié)構(gòu)完整的切片，室溫下自然晾干，浸入氯仿中室溫30 min，浸入預冷的丙酮中10 min，室溫自然晾干。PBS稍洗，切片浸入0.1%焦油紫液室溫10 min，流水沖洗3 min，95%乙醇室溫下分色，鏡下觀察控制分色時間至滿意，依次脫水透明，中性樹膠封片。每只動物取對應部位2張腦片進行光密度值統(tǒng)計，分析軟件為Image-Pro Plus。1.3.4黑質(zhì)區(qū)MAPKs通路蛋白表達的檢測 行為學檢測后，每組取6只小鼠1%戊巴比妥鈉麻醉，迅速斷頭取腦，在冰面上迅速分離出兩側(cè)黑質(zhì)，-80℃冰箱保存。黑質(zhì)組織放在平皿中并加入適量新鮮配制的RIPA裂解液，剪刀剪碎組織塊(冰上操作)；4℃ 3000 g離心5 min；棄上清，預冷PBS洗滌組織沉淀，至液體無紅色，以避免血紅蛋白的影響；將組織沉淀轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器，每30 mg組織加RIPA裂解液300 μl，冰上反復勻漿30~60 min；4℃ 14000 g離心15 min，取上清。用Bradford法定量蛋白。Western blot電泳法[6]檢驗。所有Western印跡實驗至少重復3次，電泳條帶結(jié)果分析采用AlphaEase?FC軟件，定量分析時相對密度采用磷酸化蛋白/總蛋白比值表示。

1.4 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)采用(xˉ±s)表示，以SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行單因素(one-way ANOVA)方差分析，組間比較采用多個樣本均數(shù)比較的方差分析及Tukey's HSD事后檢驗，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 行為學 模型組5 min內(nèi)的自發(fā)運動次數(shù)明顯低于對照組(P<0.01)，給藥2周后，28醇低劑量組和中劑量組5 min內(nèi)的自發(fā)運動次數(shù)與模型組無顯著性差異；而28醇高劑量組與模型組相比，自發(fā)活動次數(shù)增加(P<0.05)。模型組轉(zhuǎn)桿停留時間明顯低于對照組(P<0.01)；給藥2周后，28醇各劑量組轉(zhuǎn)桿停留時間均高于模型組(P<0.05)。見表1。

2.2 紋狀體Nissl染色 與對照組相比，模型組紋狀體區(qū)多數(shù)神經(jīng)元尼氏小體藍色顆粒減少，胞漿空泡樣變性，光密度值明顯降低(P=0.0022)；28醇中劑量和高劑量組小鼠紋狀體區(qū)與模型組相比，含有Nissl小體的神經(jīng)細胞數(shù)量顯著增多并染色加深，光密度值升高(P<0.05)。見圖1。

2.3 黑質(zhì)Western blot電泳 與對照組相比，模型組p-Erk1/2明顯降低(P=0.0052)，p-p38 MAPK(P=0.0053)、p-JNK明顯增高(P=0.0000)。28醇中劑量和高劑量組p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表達與模型組相比下降(P<0.05)，而28醇各組p-Erk1/2表達與模型組相比無顯著性差異。見圖2~圖4。

表1 各組行為學指標比較

a:與對照組比較,P=0.0062 b:與模型組比較,P=0.0473 c:與模型組比較,P=0.0143 d:與模型組比較,P=0.0238

3 討論

中國已進入老齡化社會，帕金森病已經(jīng)成為影響老年人健康的一個突出問題，嚴重影響著老年人的身體健康和生活質(zhì)量，也給家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟和人力負擔。目前帕金森病治療仍以對癥治療為主，且多數(shù)化學藥物不良反應較多，尋找新的治療藥物成為當前帕金森病研究的迫切需要。

28醇是一種從米糠蠟、甘蔗蠟等中提取的天然長鏈高級脂肪醇(CH3[CH2]27OH，分子量410.77)，可有效降低血清膽固醇水平，抗脂質(zhì)過氧化，抑制血小板凝聚，抑制血管內(nèi)皮平滑肌細胞的增生等[2]。Snider等[7]初步臨床研究顯示，一定劑量的28醇對帕金森病患者有一定的療效；且28醇在體內(nèi)吸收分布較快[8]，具有增強體力、精力和耐力，安全性和耐受性好等特點，這為帕金森病的臨床治療和干預提供了新的潛在單體藥物。

針對臨床上帕金森病患者的主要癥狀自發(fā)運動減緩、運動減少、靜止震顫和運動協(xié)調(diào)能力下降等，我們在本研究中分別進行了相應的行為學檢測，即轉(zhuǎn)桿實驗和自發(fā)運動實驗，以此評價MPTP的毒性效應和28醇治療效果。結(jié)果顯示，MPTP對黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)確切的毒性作用，給予28醇治療可改善MPTP導致自發(fā)運動和運動協(xié)調(diào)能力損害。

形態(tài)學觀察顯示，MPTP注射2周后，小鼠黑質(zhì)紋狀體通路顯著損傷，而28醇各治療組均可不同程度逆轉(zhuǎn)上述損傷。

MAPKs級聯(lián)是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)之一。細胞運用這一系統(tǒng)將胞外刺激信號傳遞給胞核，參與細胞生長、發(fā)育、分化和凋亡等一系列生理病理過程。到目前為止，在哺乳動物細胞中已至少發(fā)現(xiàn)3條主要的MAPK通路：細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)通路、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路和p38 MAPK通路[9]。ERK信號通路通常被認為在生長因子介導的細胞增殖和分化過程中發(fā)揮重要作用，并可作為阻止細胞凋亡的存活因子；JNK及p38 MAPK為應激激活的蛋白激酶，可被細胞外多種應激原，如放射線、紫外線、熱休克、高滲液和促炎因子等激活而啟動凋亡相關信號通路。

多項研究顯示，JNK和p38 MAPK參與了帕金森病的發(fā)病機制。例如JNK和p38 MAPK磷酸化形式在帕金森病患者尸檢腦中被發(fā)現(xiàn)高表達[10]，JNK抑制因子(JNK interacting protein-1,JIP-1)或JNK活化抑制劑CEP-1347/KT-7515在MPTP動物模型中對多巴胺能神經(jīng)元有神經(jīng)保護作用[11-12]。在體外實驗中，越來越多的研究表明，環(huán)境毒素魚藤酮可以通過活化JNK和p38 MAPK誘導SH-SY5Y細胞的凋亡[13-14]；6-羥多巴胺可通過激活JNK信號通路誘導分化的PC12凋亡[15]。

本研究顯示，模型組MAPKs家族3個信號通路因子活化形式中，MPTP可能通過介導p38 MAPK和JNK活化進而啟動神經(jīng)細胞凋亡過程，而Erk1/2介導的細胞增生和分化信號通路受到損害；28醇可通過調(diào)節(jié)MAPKs家族p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表達，減少MPTP對黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的損傷；28醇對Erk1/2介導的細胞增生和分化信號通路無明顯作用。

本研究前期工作發(fā)現(xiàn)，28烷醇對6-OHDA致帕金森病大鼠模型具有神經(jīng)保護作用，而其機制可能與其調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子前體(proNGF)和神經(jīng)營養(yǎng)因子(NGF)介導的細胞凋亡/存活通路相關。本研究在MPTP致帕金森病小鼠模型上驗證28醇的行為學改善作用，黑質(zhì)區(qū)MAPKs通路可能是其作用機制之一。結(jié)果顯示，大劑量28醇(100 mg/kg)可以顯著改善因MPTP神經(jīng)毒性導致的四肢運動協(xié)調(diào)能力下降及自發(fā)運動次數(shù)減少，逆轉(zhuǎn)MPTP對黑質(zhì)區(qū)酪氨酸陽性多巴胺神經(jīng)元的損傷；其神經(jīng)保護機制可能與28烷醇降低黑質(zhì)區(qū)MAPKs家族促凋亡因子蛋白表達有關。本系列研究為28烷醇成為抗帕金森病候選藥物及其應用于抗帕金森病臨床藥物干預提供了理論依據(jù)。

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Effects of Octacosanol on Behavioral Impairments and Its Mechanism through MAPKs Pathway in MPTP-treated Mice

WANG Tao,LIU Yan-yong,YANG Nan,et al.Department of Neurobiology,Beijing Institute of Geriatrics,Xuanwu Hospital,Capital Medical University,Beijing 100053,China

ObjectiveTo investigate whether octacosanol would attenuate neurotoxicity in 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6 tetrahydropyridine(MPTP)-treated C57BL/6N mice and its potential mechanism.MethodsBehavioral tests,Nissl histochemistry and Western blot were used to investigate the effects of octacosanol in this mouse model of PD.ResultsOral administration of octacosanol(100 mg/kg)significantly improved behavioral outcome in mice induced by MPTP and markedly ameliorated morphological appearances of neuronal cells in striatum.Furthermore,octacosanol blocked MPTP-induced phosphorylation of p38MAPK and JNK,but not ERK1/2.ConclusionThe protective effects afforded by octacosanol might be mediated by blocking the phosphorylation of p38 MAPK and JNK on the signal transduction in vivo.

Parkinson's disease;neuroprotecion;behavior;mitogen-activated protein kinases;octacosanol

[本文著錄格式]王濤，劉雁勇，楊楠，等.28醇對MPTP致帕金森病模型小鼠行為學的作用及其機制[J].中國康復理論與實踐,2012,18(9):820-823.

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.09.008

1.國家973基金項目(2010CB934002、2011CB504101、2011CBA00408)；2.國家自然科學基金資助項目(81050025)；3.北京市博士后工作經(jīng)費資助項目。

1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學研究室，北京市100053；2.中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所藥理室，北京市100005。作者簡介：王濤(1980-)，男，遼寧大連市人，博士，助理研究員，主要研究方向：帕金森病藥效學及機制研究。通訊作者：左萍萍。

R742.5

A

1006-9771(2012)09-0820-04

2012-05-28)

·臨床觀察·