吳金松，馬志偉，陳光靜，陳曉培，劉俊桃，張荷麗*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，鄭州 450046；2.西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

甘蔗(Saccharumofficinarum)屬草本植物禾本科，有薯蔗、糖稈、甜棒兒等別稱，甘蔗稈直立高3～5 m，根狀莖粗壯發(fā)達(dá)且多汁，是一年生或多年生的草本植物，普遍分布在熱帶和亞熱帶地域，在我國主要分布在兩廣、貴州等地區(qū)[1]。甘蔗中富含多種糖類、蛋白質(zhì)、維生素(B1,B2,B6)、蔗脂、鈣、磷、鐵、植物甾醇、氨基酸等營養(yǎng)成分[2]。由于甘蔗是生產(chǎn)食糖的主要原料，每年的制糖工業(yè)會(huì)產(chǎn)生大量的甘蔗廢渣，如處理不當(dāng)不但會(huì)引起資源浪費(fèi)，同時(shí)也會(huì)造成環(huán)境污染[3]。甘蔗渣中富含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素以及多糖酚類等活性成分，其目前用途主要在燃料、造紙工業(yè)、木材、糖發(fā)酵、飼料、微生物培養(yǎng)基等方面，而關(guān)于甘蔗渣中活性多糖的提取純化、活性研究報(bào)道較少[4-9]。趙毅[10]發(fā)現(xiàn)從甘蔗渣中以及制糖中提取出的糖蜜內(nèi)，含有對(duì)小鼠艾氏癌和肉瘤-180有抑制作用的活性多糖物質(zhì)。因此，探究甘蔗渣中的水溶性多糖提取工藝對(duì)于甘蔗渣資源的再利用具有重要意義。

活性多糖的分離提取工藝通常包括酸堿水解法、溶劑提取法、酶解法以及物理強(qiáng)化輔助提取法(超聲波、微波輔助提取)等[11-13]。肖亞聰?shù)萚14]通過比較不同的甘蔗渣多糖提取工藝，綜合分析對(duì)比得出酶解法比水提法的得率高，并且提取時(shí)間短，但是酶法輔助提取會(huì)引入蛋白酶等雜質(zhì)，不利于后續(xù)的分離純化；陳興興等[15]通過超聲波提取法對(duì)甘蔗渣多糖的提取工藝進(jìn)行研究，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，超聲波輔助提取法的原理是根據(jù)超聲波在液體中產(chǎn)生的空化效應(yīng)，從而加快植物細(xì)胞中有效成分的溶出，但是極易造成甘蔗渣大分子多糖結(jié)構(gòu)的破壞。本文采用水提醇沉法提取甘蔗渣中水溶性粗多糖，首先探究了不同單因素(例如提取溫度、提取時(shí)間、水料比、乙醇終濃度等)對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化，確定甘蔗渣水溶性粗多糖較佳的提取工藝條件，為工業(yè)化提取甘蔗渣多糖在功能食品、藥品等領(lǐng)域的應(yīng)用開發(fā)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

紫皮甘蔗 鄭州市中牟萬邦果蔬批發(fā)市場(chǎng)；無水乙醇 新鄉(xiāng)市三偉消毒制劑有限公司；葡萄糖標(biāo)品 天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；硫酸 洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；苯酚 天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA3204B分析天平(感量0.0001 g) 上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；HH-2型電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；101-1型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器有限公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司； BJ-150多功能粉碎機(jī) 德清拜杰電器有限公司；Hanon i2可見光分光光度計(jì) 濟(jì)南海能儀器股份有限公司；TU-1901雙光束紫外可見光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甘蔗渣水溶性粗多糖提取工藝流程

1.3.1.1 去皮、榨汁(收集甘蔗渣)、烘干、粉碎、過篩

先將新鮮的紫皮甘蔗 刮去外皮(留皮會(huì)影響粉碎效果)，然后除去甘蔗汁，收集的甘蔗渣經(jīng)漂燙后放入干燥箱中60 ℃烘干，再用粉碎機(jī)將其粉碎，并過60目篩后，放置于密封袋中常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 水提

將稱好的甘蔗渣粉放入不同料液比蒸餾水的燒杯中，放入恒溫水浴鍋中，在設(shè)定不同溫度和時(shí)間的提取條件下浸提，提取過程要用玻璃棒不斷進(jìn)行攪拌，避免甘蔗渣粉粘黏燒杯壁而影響浸提效果。

1.3.1.3 離心分離(或抽濾分離)

水提完成后，將其從水浴鍋中取出冷卻后分離上清液與沉淀。再以同樣的水提條件將沉淀重復(fù)浸提，過濾后丟棄沉淀物，將2次的上清液歸并在一起。

1.3.1.4 上清液濃縮

用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(轉(zhuǎn)速90 r/min，極限真空度0.1 MPa，55 ℃)或蒸餾裝置蒸餾濃縮，將上清液濃縮至剩余10～20 mL。

1.3.1.5 醇沉

將濃縮后的提取液緩慢加入，與一定比例4 ℃的無水乙醇混合(形成不同的乙醇終濃度)，然后放置于4 ℃的冰箱中靜止12 h左右，會(huì)有白色物質(zhì)從溶液中沉淀出來，將沉淀物與上清液抽濾分離，收集沉淀，將沉淀物置于60 ℃的恒溫干燥箱中干燥。

1.3.2 甘蔗渣粗多糖不同提取條件的單因素試驗(yàn)

參考相關(guān)文獻(xiàn)[16,17]，最終采用水提醇沉法，影響甘蔗渣粗多糖提取的主要因素有提取時(shí)間、提取溫度、料液比、提取次數(shù)和乙醇醇沉濃度等。本試驗(yàn)以料液比、乙醇醇沉終濃度(%)、提取溫度(℃)和提取時(shí)間(h)為單因素條件，探究其對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響。

1.3.2.1 不同提取時(shí)間(h)對(duì)甘蔗渣中粗多糖提取率的影響

稱取 5 g 甘蔗渣粉，固定料液比1∶30→在80 ℃的恒溫水浴鍋中分別浸提1,2,3,4,5 h(各水提2次)→真空抽濾出上清液→歸并2次抽濾的上清液→將上清液濃縮→再以70%的乙醇終濃度沉淀12 h→最后測(cè)定甘蔗渣粗多糖的提取率。

1.3.2.2 不同料液比對(duì)甘蔗渣中粗多糖提取率的影響

稱取5 g甘蔗渣粉，選取不同的料液比(分別為1∶10,1∶20,1∶30,1∶40,1∶50)→在80 ℃的恒溫水浴鍋中提取2 h(各水提2次)，后續(xù)試驗(yàn)方法同1.3.2.1。

1.3.2.3 不同提取溫度對(duì)甘蔗渣中粗多糖提取率的影響

稱取5 g甘蔗渣粉→固定料液比為1∶30→在不同提取溫度(分別為60,70,80,90,100 ℃)的恒溫水浴鍋中提取2 h(各水提2次)，后續(xù)試驗(yàn)方法同1.3.2.1。

1.3.2.4 不同乙醇終濃度對(duì)甘蔗渣中粗多糖提取率的影響

稱取5 g甘蔗渣粉→固定料液比為1∶30、提取溫度設(shè)定為80 ℃、提取時(shí)間為2 h(各水提2次)→真空抽濾上清液→歸并2次抽濾的上清液→濃縮上清液→選取乙醇終濃度分別為50%,60%,70%,80%,90%進(jìn)行沉淀，靜置12 h→最后測(cè)定粗多糖的提取率。

1.3.3 甘蔗渣中粗多糖提取工藝的正交試驗(yàn)[18]

為了確定從甘蔗渣中提取多糖的最佳工藝條件，綜合比較各單因素對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率影響的試驗(yàn)結(jié)果，選定提取次數(shù)為2次浸提，以提取溫度、提取時(shí)間、料液比、乙醇終濃度為正交試驗(yàn)優(yōu)化的4個(gè)單因素，進(jìn)行以上四因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)。試驗(yàn)不同因素水平和具體安排見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Orthogonal test factor-level table

1.3.4 甘蔗渣粗多糖提取率的測(cè)定

1.3.4.1 葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用硫酸-苯酚法[19-21],取10 g左右的葡萄糖放置于105 ℃的干燥箱中烘至恒重，干燥器中冷卻后準(zhǔn)確稱量0.100 g，用蒸餾水溶解后定容到100 mL的棕色容量瓶中，配制成葡萄糖儲(chǔ)備液(濃度為1.0 mg/mL)，從儲(chǔ)備液中精確吸取5 mL于50 mL的棕色容量瓶中，加蒸餾水至定容刻度線，得到濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖供試液。再配制濃度為5%的無水苯酚溶液(用移液管精確移取50 mL苯酚溶液到1000 mL容量瓶中并定容至刻度線，放入棕色瓶中避光保存?zhèn)溆?。備好潔凈干燥的試管，用移液管分別準(zhǔn)確移取0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL的0.1 mg/mL供試液至試管中，按序加入蒸餾水使總體積達(dá)到1.0 mL。再加入1 mL 5%的苯酚溶液充分混勻后，迅速加入5 mL的濃硫酸，立即震蕩混勻(做3組平行)，靜止30 min。以空白試液(1 mL蒸餾水+1 mL苯酚+5 mL濃硫酸)為參比，用可見光光度計(jì)于室溫下測(cè)定490 nm處的吸光值。根據(jù)所測(cè)溶液的吸光值繪制線性回歸方程，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出多糖水解液中的總糖含量(μg/mL)。

1.3.4.2 甘蔗渣粗多糖提取率的測(cè)定

將抽提低溫鼓風(fēng)干燥過的甘蔗渣粗多糖沉淀物于250 mL容量瓶中用蒸餾水溶解，定容到標(biāo)線后搖勻。然后用移液管分別精確吸取2 mL溶液，定容至50 mL的容量瓶中倒轉(zhuǎn)晃動(dòng)，使溶液混合均勻。然后從中量取1 mL甘蔗渣粗多糖溶液，依次加入1 mL的5%苯酚溶液混勻，迅速加入5 mL的濃硫酸，搖勻后靜止30 min。以空白試液做參比，用可見光光度計(jì)于室溫下測(cè)定490 nm處的吸光值。參照總糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方程，將吸光度值代入線性回歸方程可計(jì)算出甘蔗渣粗多糖的濃度C。甘蔗渣粗多糖提取率的計(jì)算公式如下：

式中：C為樣品葡萄糖濃度(μg/mL)；V為甘蔗渣多糖溶液總體積(mL)；D為稀釋倍數(shù)；M為甘蔗粉質(zhì)量(g)。

1.3.5 甘蔗渣粗多糖的紫外全波段掃描

取干燥后的甘蔗渣粗多糖，配制成0.5 mg/mL的粗多糖溶液，于紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行全波段掃描(190～400 nm)[22]。

1.3.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析方法

利用正交優(yōu)化軟件和SPSS 19.0軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的分析與處理，使用Origin 8.7和Excel 2007進(jìn)行圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗渣粗多糖總糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照葡萄糖濃度和測(cè)得的吸光度計(jì)算出線性回歸方程為y=0.0103x-0.0192, R2=0.9996，總糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 甘蔗渣粗多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of bagasse polysaccharides

2.2 單因素試驗(yàn)對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響

2.2.1 不同提取時(shí)間對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響

圖2 不同提取時(shí)間對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響Fig.2 The effect of different extraction time on the extraction rate of crude polysaccharides from bagasse

由圖2可知，隨著提取時(shí)間不斷增加，甘蔗渣粗多糖不斷溶解于水中，提取率也隨之提高，提取時(shí)間在1～5 h內(nèi)時(shí)提取率增加顯著，所以為提高提取效率和節(jié)約成本，應(yīng)選定時(shí)間為2,3,4 h 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)為宜。

2.2.2 不同料液比對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響

圖3 不同料液比對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響Fig.3 The effect of different material-liquid ratios on the extraction rate of crude polysaccharides from bagasse

由圖3可知，在料液比1∶10～1∶30范圍內(nèi)，甘蔗渣粗多糖的提取率隨料液比的增長而逐步增長，且增長趨勢(shì)十分顯著。在料液比增加至1∶30后提取率呈下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)楫?dāng)料液比過高時(shí)，甘蔗渣中的其他雜質(zhì)成分也都溶析出來，導(dǎo)致提取率的降低。但是當(dāng)料液比為1∶10時(shí)提取率最低，可能由于在提取溶劑用量較少時(shí)，甘蔗渣多糖沒有充分溶解，也不利下一步抽濾。此外，料液比例過高時(shí)，浸提體系的總體積增加，導(dǎo)致后續(xù)濃縮工藝的成本增加，為提高提取工藝效率，選擇1∶20,1∶30,1∶40 3個(gè)水平的料液比進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.2.3 不同提取溫度對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響

圖4 不同提取溫度對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響Fig.4 The effect of different extraction temperatures on the extraction rate of crude polysaccharides from bagasse

由圖4可知，隨著提取溫度的不斷升高，甘蔗渣粗多糖的提取率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在60～80 ℃水提溫度下，提取率隨溫度的上升而增加，水提溫度在80 ℃左右時(shí)提取率達(dá)到最大，但在80～100 ℃時(shí)呈下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)闇囟容^高引起破壁效應(yīng)加劇導(dǎo)致多糖分解，進(jìn)而提取率也隨之下降，所以選擇提取溫度的3個(gè)水平70，80，90 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)為宜。

2.2.4 不同乙醇終濃度對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響

圖5 不同乙醇終濃度對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響Fig.5 The effect of different final ethanol concentration on the extraction rate of crude polysaccharides from bagasse

由圖5可知，隨著乙醇最終沉淀濃度的不斷提升，甘蔗渣粗多糖的提取率不斷增加，且增加顯著，所以選擇乙醇最終沉淀濃度為70%，80%，90%進(jìn)行后續(xù)的正交試驗(yàn)。

2.3 水提醇沉法提取甘蔗渣粗多糖試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)優(yōu)化甘蔗渣粗多糖的提取工藝試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

由表2可知，4個(gè)單因素對(duì)結(jié)果的影響程度為B>A>C>D，即影響要素的關(guān)系依次排序?yàn)橐掖冀K濃度>料液比>提取溫度>提取時(shí)間，提取時(shí)間的影響不顯著，綜合提取率和提取效率考慮，得出最優(yōu)組合為A2B3C1D2，即最佳提取工藝條件為料液比1∶30，乙醇終沉淀濃度90%，水提溫度70 ℃，水提時(shí)間3 h。在此提取條件下，甘蔗渣粗多糖的提取率為 1.03%。

2.4 甘蔗渣粗多糖的紫外吸收曲線

圖6 甘蔗渣粗多糖溶液的紫外掃描圖譜Fig.6 Ultraviolet spectrum of crude polysaccharides solution from bagasse

由圖6可知，在波長190～400 nm范圍內(nèi)，甘蔗渣粗多糖溶液經(jīng)過紫外吸收掃描后， 在260～280 nm 處均無明顯的吸收峰，說明其不含或含有極少量的核酸和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。

3 結(jié)論

通過水提醇沉法，結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化，得出甘蔗渣中水溶性多糖的最佳提取工藝條件為：料液比1∶30，乙醇終沉淀濃度90%，水提溫度70 ℃，水提時(shí)間3 h。在此提取條件下，甘蔗渣粗多糖的提取率為 1.03%。通過對(duì)甘蔗渣粗多糖溶液的紫外掃描，在260～280 nm 處均無明顯吸收峰，進(jìn)一步說明了該提取工藝條件的可靠性。提取到的甘蔗渣粗多糖有待于進(jìn)一步的純化，為甘蔗渣多糖的活性探究和結(jié)構(gòu)鑒定打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。