張?jiān)裕Y云升，王樂(lè)園，瞿文杰

(揚(yáng)州大學(xué) 旅游烹飪學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127)

真空包裝素皮鴨是由干豆腐皮經(jīng)鹵水鹵制，經(jīng)過(guò)蒸煮、冷卻、油炸、浸煮、瀝干等工序后真空包裝而成的即食炸鹵豆腐皮，因其炸鹵后豆腐皮表面顏色類似烤鴨皮，故稱為素皮鴨。豆腐皮中含有45%蛋白質(zhì)，14%脂肪，且具有人體所需維生素、氨基酸及微量元素，具有高蛋白、低脂肪、易吸收、營(yíng)養(yǎng)高的特色，成為大多素食產(chǎn)品的主要原料[1]。近年來(lái)，由于素食的消費(fèi)市場(chǎng)逐漸擴(kuò)大，真空包裝素皮鴨的銷售量也在逐步提高，但因其營(yíng)養(yǎng)豐富，易為微生物提供生長(zhǎng)條件而導(dǎo)致產(chǎn)品脹袋變質(zhì)，從而限制產(chǎn)品的銷售范圍和貨架期[2]。因此，探究素皮鴨的優(yōu)勢(shì)腐敗菌及菌相構(gòu)成，從而采取針對(duì)性措施以控制其質(zhì)量安全，成為企業(yè)急切需要解決的問(wèn)題。

本文采用選擇性培養(yǎng)基劃線分離單個(gè)菌落，對(duì)真空包裝素皮鴨的主要微生物菌群進(jìn)行純化，依照觀察菌體形態(tài)和菌落特征[3]，進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)等方法初步鑒定素皮鴨中的優(yōu)勢(shì)菌，從而為貯藏、運(yùn)輸、銷售過(guò)程中對(duì)微生物生長(zhǎng)繁殖的有效控制提供理論依據(jù)，以達(dá)到延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期的目的。

1 材料與試劑

1.1 工藝流程

每25 g素皮鴨產(chǎn)品分裝，于4 ℃冷藏7天，隨機(jī)取樣進(jìn)行微生物分析。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

選擇培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、Pseudomonades培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、VRBGA培養(yǎng)基、MSA培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基：購(gòu)于上海博微生物科技有限公司；革蘭氏染色液、3% H2O2、0.02%甲基紅、格里斯氏試劑等：由實(shí)驗(yàn)室配制；微量生化反應(yīng)管：購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

冰箱(BCD-203型)；電子天平(DT-200型)；恒溫水浴鍋型(HH-8型)；恒溫恒濕培養(yǎng)箱(HSX-250型)；全溫培養(yǎng)搖床(QYC-200型)；生物顯微鏡(XSP-13A型)；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器(YX280B型)；單人雙面凈化工作臺(tái)(SW-CJ-1F型)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9148A型)。

2 方法

2.1 微生物分離與純化

以無(wú)菌操作要求，取樣品25 g剪碎，放入225 mL 0.85%無(wú)菌生理鹽水中，均質(zhì)20 min，取1 mL上清液，依次按1∶10遞增稀釋，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)。采用平板傾注法在45 ℃下培養(yǎng)并每隔24 h進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定。從菌落總數(shù)平板上挑取典型生長(zhǎng)菌落，在各相應(yīng)的平板上劃線分離，分離純化2～3次，得到純化的單個(gè)菌落，分別接種于相應(yīng)培養(yǎng)基斜面保存，用于菌種的初步鑒定與觀察。培養(yǎng)基的選擇及培養(yǎng)條件見(jiàn)表1。

表1 各菌的選擇性培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件Table 1 Culture media and conditions of different bacteria

2.2 優(yōu)勢(shì)菌鑒定

2.2.1 菌體形態(tài)和菌落特征觀察

菌體形態(tài)：革蘭氏染色分陰性和陽(yáng)性；芽孢形狀、著生位置及芽孢囊的形狀。

菌落特征：菌落大??；表面形狀(光滑、皺褶、顆粒狀)；隆起程度(擴(kuò)展、隆起)；邊緣形狀(整齊、波浪狀、齒輪狀)；菌落形態(tài)(單個(gè)、成群、鏈狀)；表面光澤；菌落質(zhì)地(油脂狀、粘稠狀)；菌落顏色(乳白色、蠟黃色、粉紅色、紫紅色、橘紅色)；透明程度(透明、半透明、不透明)。

2.2.2 生理生化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[4]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[5]對(duì)各菌株進(jìn)行接觸酶實(shí)驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵(O/F)實(shí)驗(yàn)、精氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)、精氨酸雙水解酶實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、動(dòng)力實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 優(yōu)勢(shì)菌的初步鑒定

3.1.1 素皮鴨中菌株的菌種特征和菌體形態(tài)

通過(guò)革蘭氏染色后鏡檢，油鏡觀察各種菌體形態(tài)及其在選擇性培養(yǎng)基上的菌種特征，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 素皮鴨中分離出的各菌株形態(tài)特征Table 2 The morphological characteristics of strains isolated from fried and marinated bean curd stick

3.1.2 生理生化實(shí)驗(yàn)分析

根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》及《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，通過(guò)油鏡觀察的菌體形態(tài)、革蘭氏染色情況等，結(jié)合表3的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步鑒定：X1為芽孢桿菌，X2為腸桿菌，X3為假單胞菌，X4為乳酸菌，X5為葡萄球菌。

表3 素皮鴨中各類菌種的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strains from fried and marinated bean curd stick

注：+表示陽(yáng)性；-表示陰性；/表示未實(shí)驗(yàn)。

3.2 素皮鴨的初始菌相構(gòu)成

測(cè)定真空包裝素皮鴨的細(xì)菌菌落數(shù)達(dá)2.8×105cfu/g，其初始菌落菌相構(gòu)成見(jiàn)圖1，素皮鴨樣品的初始菌相以乳酸菌(39%)、假單胞菌(29%)和腸桿菌(24%)為主，其次為球菌(5%)和酵母菌(3%)。

圖1 素皮鴨初始菌相構(gòu)成Fig.1 Original bacterial flora composition of fried and marinated bean curd stick

3.3 素皮鴨保藏過(guò)程中各類菌群的變化

真空包裝的素皮鴨成品在4 ℃保藏過(guò)程中各類菌群的變化見(jiàn)圖2。

圖2 素皮鴨4 ℃保藏過(guò)程中各類菌群變化Fig.2 The changes of several microbial flora in the process of vacuum-packed fried and marinated bean curd stick stored at 4 ℃

由圖2可知，在4 ℃冷藏條件下，真空包裝素皮鴨中乳酸菌、假單胞菌占主導(dǎo)地位，成品最終因乳酸菌、假單胞菌和腸桿菌的大量增長(zhǎng)而腐敗變質(zhì)。

保藏7天中，乳酸菌一直平穩(wěn)增長(zhǎng)，最終成為保藏期間的優(yōu)勢(shì)菌，可能由于乳酸菌不斷產(chǎn)乳酸、醋酸等酸性代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致真空包裝素皮鴨腐敗變質(zhì)后有酸敗味。保藏前2天，假單胞菌緩慢生長(zhǎng)，但從第4天開(kāi)始呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，最終成為真空包裝素皮鴨的第二大優(yōu)勢(shì)菌。Raats D等[6]研究真空包裝的豆腐于3 ℃貯藏，其主要優(yōu)勢(shì)菌為乳酸菌和假單胞菌，這和本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。

腸桿菌雖然增殖緩慢，但仍屬第三大優(yōu)勢(shì)菌，其來(lái)源可能是生產(chǎn)環(huán)境和生產(chǎn)過(guò)程及生產(chǎn)操作人員等。球菌和酵母菌在整個(gè)菌相分析過(guò)程中，雖然可以測(cè)定但兩者含量較低，尤其在腐敗終點(diǎn)時(shí)，兩者含量均呈最低值。在保藏前4天，酵母菌一直穩(wěn)定增長(zhǎng)，當(dāng)?shù)?天達(dá)到最高值，第5天開(kāi)始逐漸下降。球菌在保藏前2天內(nèi)，仍有增長(zhǎng)趨勢(shì)，但第3天開(kāi)始逐漸平穩(wěn)下降，最終認(rèn)定球菌和酵母菌不能成為優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)從真空包裝素皮鴨中分離出5株菌種，經(jīng)菌體特征、菌落形態(tài)、生理生化實(shí)驗(yàn)分析，初步鑒定：1株芽孢桿菌,1株腸桿菌，1株假單胞菌，1株乳酸桿，1株葡萄球菌。另本實(shí)驗(yàn)中將營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板涂布菌液后于厭氧條件下培養(yǎng)，結(jié)果表明平板上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，說(shuō)明此菌為好氧或兼性厭氧，結(jié)合菌體特征、菌落形態(tài)、生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步判斷素皮鴨中可能帶有芽孢桿菌，彭玲慧等[7]在真空包裝的鹵豆干脹袋后，分離鑒定出1株優(yōu)勢(shì)腐敗菌為蠟樣芽孢桿菌，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果較吻合。在4 ℃冷藏條件下，乳酸菌、假單胞菌和腸桿菌是主要的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，可為延長(zhǎng)素皮鴨貨架期提供研究基礎(chǔ)。