谷娜 鞠志新 史春鳳

【摘 要】 試驗通過TTC染色、含水量測定、石蠟切片、萌發(fā)實驗的方法，綜合研究山西杓蘭種子的形態(tài)特征及萌發(fā)特性。結(jié)果表明：山西杓蘭染色率在48%-57%之間；平均含水量為32.67%；成熟種子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)簡單，有內(nèi)外雙層種皮，沒有胚乳；胚體為球形胚；山西杓蘭種子成熟狀態(tài)下發(fā)芽率很低，通過不同的外界環(huán)境的刺激，相比未處理的種子發(fā)芽從0提率高到2.9%，其中GA3濃度和溫度對種子發(fā)芽率的影響最大。通過對山西杓蘭種子形態(tài)特征與萌發(fā)特性的研究，為合理有效的保護這一瀕危物種提供科學(xué)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 山西杓蘭；種子；生活力；含水量；形態(tài)特征；萌發(fā)特性

[Abstract] The morphological characteristics and germination characteristics of the seeds were studied by TTC staining， water content determination， paraffin section and germination experiment. The results showed that the dyeing rate was between 48% and 57%. The average moisture content was 32.67%； The inner structure of the mature seeds is simple， and there is no endosperm. The embryo is a spherical embryo； Shanxi mature state of wild flower seeds germination rate is very low， through the stimulation of different external environment， compared with the untreated seed germination rate from 0 to 2.9%， including GA3 concentration and temperature effect on the seed germination rate is the largest. Based on the study of the morphological characteristics and germination characteristics of the seeds of Shanxi， it provides a scientific basis for the reasonable and effective protection of this endangered species.

[Key words] cypripedium shanxiense S. C. Chen； seeds； life force； water content； morphological characteristics； germination characteristics

蘭科杓蘭屬植物為陸生草本植物，有獨特的囊狀唇瓣，造型奇異，是具有很高的觀賞和藥用價值的物種。杓蘭屬植物自然繁衍能力較差且種子極小，地生蘭種子的萌發(fā)十分困難，隨著人們對野生蘭花的過度采集，其野生種群處于嚴重瀕危狀態(tài)。山西杓蘭被列為國家一級重點保護野生植物，觀賞特性高而無法應(yīng)用于園林生產(chǎn)。通過對山西杓蘭種子形態(tài)特征與萌發(fā)特性的研究，為合理有效的保護這一瀕危物種提供科學(xué)依據(jù)，也為該物種進一步研究提供基礎(chǔ)資料，并且對山西杓蘭的種苗繁育并應(yīng)用于園林具有實踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗種子于2013年采摘自吉林省通化市，一直低溫儲藏。所用試驗儀器及藥品有：切片機、顯微鏡、恒溫箱、烘干箱等儀器，無水乙醇（95%）、冰醋酸、甲醛、二甲苯、明膠、甘油、固體石蠟、蕃紅、固綠等藥品，均由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院園林實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子生活力的測定 按常規(guī)方法配置1%TTC溶液，選取若干種子在40℃溫水中浸泡，浸泡2d后，隨機取3份種子，每份50粒，沿種胚中央切開，取每粒種子的一半備用。將種子放入帶蓋子的玻璃小瓶中，每瓶10mL TTC溶液，在20℃黑暗條件下染色3h，著色后將種子取出，用水沖洗干凈，在尼康體視顯微鏡下觀察種子染色情況，分別計算種子的染色率、未染色率、有胚率。

1.2.2 種子含水量的測定 采用直接烘干法測定種子的含水量。測定時取三次重復(fù)，分別測定格樣品在80℃條件下烘干2h、4h、6h、8h、10h的干重。含水量（% ）=（M2-M3）/（M2-M1） ×100%，式中：M1培養(yǎng)皿的重量（g）；M2培養(yǎng)皿及樣品的烘前重量（g）； M3培養(yǎng)皿及樣品的烘后重量（g）。

1.2.3 制作石蠟切片 將種子在FAA固定液固定，將固定好的種子放入一系列系列濃度的酒精中逐級脫水，其順序如下： 30%→50%→70%→85%→95%→100%→100%。脫水的種子放入酒精與二甲苯配比至純二甲苯中進行透明，其順序為：1/2酒精+1/2二甲苯（2h）→純二甲苯（1h）→純二甲苯（1h），放入37℃溫箱中 24h 以上。再將材料浸入二甲苯∶石蠟=1∶1的溶液中，這個過程放入60℃溫箱中經(jīng)過3d后，改變混合液中二甲苯與石蠟的比例，分別從 1∶1→1∶2→純石蠟→純石蠟（每個過程3d）。迅速把材料按需要的切面及材料之間的間隔排列整齊，然后平放于冷水中，使其迅速凝固。待充分冷卻凝固后，將包埋塊修成梯形。利用切片機將材料切成厚度為 8μm 的連續(xù)切片。在清潔的載玻片上均勻涂上一層粘貼劑（粘貼劑為明膠黏貼劑），在上面滴上一滴蒸餾水，將切割好的材料放在上面，然后將載玻片放在恒溫箱（42℃）中幾十秒，待蠟帶伸展平整后，移入 45℃的烘箱中干燥 24 h。將烘干后的帶有材料的載玻片放入二甲苯中脫蠟，然后進行復(fù)水，其順序如下：二甲苯→1/2酒精+1/2二甲苯→100%→95%→85%→70%→50%→30（每一步驟10min）。番紅和固綠對染，其順序為：1%的番紅水溶液（12h）→30%乙醇（5min）→50%乙醇（5min）→70%乙醇（5min）→80%乙醇（5min）→0.5%固綠（40s）→100%乙醇（30s）→100%乙醇（5min）→1/2酒精+1/2二甲苯（5min） →二甲苯（5min）。染好色的切片用加拿大樹膠封固。讓其自然干固（或放入37℃溫箱中烘1d）即制成永久切片。

1.2.4 種子發(fā)芽率的測定 根據(jù)溫度、赤霉素濃度、光照時間設(shè)計3因素3水平正交試驗， 試驗在光照培養(yǎng)箱中進行，提供不同萌發(fā)條件。實驗共12組，其中3組對照試驗，每組去種子1000粒。所設(shè)計的正交試驗表如表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子的生活力

山西杓蘭種子的染色率、未染色率、有胚率等生理性狀如表1。山西杓蘭種子蒴果，近梭形或狹橢圓形，種子極小，呈單粒分散狀；供試種子開散，顏色為棕褐色，成熟開裂，肉眼不可觀察。TTC染色后在顯微鏡下觀察，未著色的種子，整個種皮被染成淺紅色，種子內(nèi)觀察不到胚。而著色的種子，透過半透明的淺褐色種皮，能清楚地觀察到染成紅色的圓球形的胚。正常發(fā)育的種子大部分能染成深紅色，顏色深淺會略有不同。三組試驗有胚率分別為72%、89%、85%，相互之間差異不顯著，平均有胚率為82%。染色率分別為48%、57%、53&，平均染色率為52.6%，三者之間差異不顯著。未染色率則分別為52%、43%、47%。

2.2 種子的含水量

山西杓蘭種子的含水量如表2。經(jīng)過三次重復(fù)試驗，得到結(jié)果如下：種子的含水量分別為27.41%、22.03%、48.57%，最高含水量為48.57%，平均含水量為32.67%。一般種子成熟時的安全含水量要低于12%才能達到安全臨界含水量，山西杓蘭成熟種子的含水量雖然為32.67%，但含水量不高，有利于種子成熟后在一段時期內(nèi)保持活性。

2.3 種子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察

制作成石蠟切片后在光學(xué)顯微鏡下觀察種子內(nèi)部胚結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：山西杓蘭的成熟的種子結(jié)構(gòu)簡單，有內(nèi)外雙層種皮，沒有胚乳；胚體為球形胚；外珠被發(fā)育成的外種皮細胞形成紡錘形的輪廓， 內(nèi)珠被發(fā)育成一層能被番紅染色的致密的干膜質(zhì)內(nèi)種皮。內(nèi)外種皮間是巨大的空氣腔，有利于該微小種子成熟后的散布。圖1種子橫縱切面圖（比例尺為100um）。

2.4 不同處理組合對種子發(fā)芽率的影響

不同的處理組合對山西杓蘭種子萌發(fā)都具有促進作用，明顯提高了發(fā)芽率和發(fā)芽率。從表3-3可以看出發(fā)芽率從0%提高到2.9%，其中光周期和溫度對種子發(fā)芽率的影響最大，20℃、250㎎/l GA3、8h光照 16h黑暗的組合處理種子發(fā)芽率達到最高，為2.9%；25℃、500㎎/l GA3、8h光照 16h黑暗的處理組合發(fā)芽率也達到了2.6%。而20℃、125㎎/l GA3、12h光照 12h黑暗的處理組合發(fā)芽率也有2.1%。

3 結(jié)論與討論

山西杓蘭的種子蒴果，近梭形或狹橢圓形，種子極小，呈單粒分散狀，種子在成熟時安全臨界含水量高于12%，但是平均含水量為32.67%，說明種子含水量不高，有利于種子成熟后在一段時期內(nèi)保持活性。TTC染色實驗中，發(fā)現(xiàn)供試種子種皮薄，半透明淺褐色。未著色的種子，呈白色或整個種皮被染成淺紅色；種子內(nèi)觀察不到胚。而著色的種子，透過半透明的淺褐色種皮，能清楚地觀察到染成紅色的圓球形的胚。在制作成石蠟切片試驗中，成片后在光學(xué)顯微鏡下更能清晰的觀察到種子的內(nèi)部胚結(jié)構(gòu)：成熟的種子結(jié)構(gòu)簡單，有內(nèi)外雙層種皮，沒有胚乳；胚體為球形胚；外珠被發(fā)育成的外種皮細胞形成紡錘形的輪廓， 內(nèi)珠被發(fā)育成一層能被番紅染色的致密的干膜質(zhì)內(nèi)種皮。內(nèi)外種皮間是巨大的空氣腔，有利于該微小種子成熟后的散布。

TTC染色是通過化學(xué)反應(yīng)間接手段測定種子的生活力，種子萌發(fā)實驗是一種常規(guī)的、更為直接的種子生理活性測定方式。對山西杓蘭成熟種子不同培養(yǎng)條件下進行萌發(fā)試驗，結(jié)果表明山西杓蘭成熟種子對照組的發(fā)芽率很低，在大花杓蘭種子形態(tài)特征與生活力測定中， 成熟種子無菌播種實驗，萌發(fā)率為零。為了提高種子的發(fā)芽率，試驗通過改變外界環(huán)境條件，如溫度、光周期、GA3濃度等，對山西杓蘭種子進行刺激，其中光周期和溫度對種子發(fā)芽率的影響最大，20℃、250㎎/L GA3、8h光照 16h黑暗的組合處理種子發(fā)芽率達到最高，為2.9%；25℃、500㎎/L GA3、8h光照 16h黑暗的處理組合發(fā)芽率也達到了2.6%；而20℃、125㎎/L GA3、12h光照 12h黑暗的處理組合發(fā)芽率也有2.1%。相比未處理的種子發(fā)芽率從0%提高到2.9%，雖然發(fā)芽率還不是很高，但還是一定程度上提高了種子的發(fā)芽率。

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