張?jiān)? 欒鑫超 侯殿雅 于麗莉 徐亞維 楚海嬌

【摘 要】 本研究人工設(shè)計(jì)合成了具有SOD和GPx氨基酸一級序列的小肽，將目的蛋白中活性部位的化學(xué)修飾位點(diǎn)設(shè)計(jì)成Cys，同時(shí)將其它位點(diǎn)的Cys變成不影響結(jié)構(gòu)的其他氨基酸獲得人工合成的76個(gè)氨基酸的抗氧化肽序列，嘗試?yán)肊.coli的營養(yǎng)缺陷型表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行76肽模擬物的表達(dá)，并對表達(dá)的肽活性進(jìn)行鑒定，預(yù)期為抗氧化模擬物的研究提供一些理論參數(shù)。

【關(guān)鍵詞】 雙酶蛋白制備；蛋白表達(dá)；活性分析

[Abstract] In this study the artificial design was synthesized with SOD and GPx amino acid sequence of small peptide， the active site of target protein modification sites designed Cys， at the same time will not affect the structure of other sites of Cys become available from other amino acids 76 synthetic antioxidant peptide sequence of amino acids， and try to take advantage of e.c. with our fabrication： oli auxotroph expression system for the expression of 76 peptide analogues， and the expression of peptide activity appraisal， expectations for oxidation of simulation study provides some theoretical parameters.

[Key words] double enzyme protein preparation； protein expression； activity analysis

天然抗氧化酶穩(wěn)定性差、來源受限且分子量較大等缺點(diǎn)一直限制其在各個(gè)領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用。由于抗氧化酶對維持正常生命活動的重要性，使得科學(xué)家們一直在利用模擬手段去設(shè)計(jì)并改造天然抗氧化酶，以便闡明酶催化反應(yīng)機(jī)理和提高其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。但機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶是通過協(xié)同作用來維持該系統(tǒng)平衡的，且進(jìn)程也復(fù)雜多變，因此，對于單一功能酶的研究和模擬顯然不能深入理解這個(gè)復(fù)雜的抗氧化酶系統(tǒng)，開展具有抗氧化能力的多功能酶的模擬勢在必行[1]。

在此之前，我們利用近幾年的時(shí)間對具有SOD和GPx活力的模擬酶進(jìn)行了一部分研究，以SOD和GPx序列為基礎(chǔ)，基于模塊酶的設(shè)計(jì)理念，我們構(gòu)建了一個(gè)具有谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶雙酶活性的含硒65肽，但由于其分子量較大，很難進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。故此，我們在此65肽的氨基端連接上人免疫缺陷病毒反式轉(zhuǎn)錄激活因子的蛋白穿膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，即細(xì)胞穿膜肽，使其具有穿透生物膜的能力，獲得76肽模擬物，并在大腸桿菌中成功融合表達(dá)，再通過硒化，得到了具有SOD和GPx活力的模擬酶。

1 材料

1.1 試驗(yàn)材料

65P肽（HQHQFGDLSQGAESTGPHYNPLAVPHPQHPGDWGNFAVRDGSLWPFLRHVYGRPRACVV HAGED）由本實(shí)驗(yàn)室保留，大腸桿菌克隆菌株E. coli pET22b由本實(shí)驗(yàn)室保留。

1.2 主要試劑

核酸染料（SYBR?GreenⅠ）、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000，DL15000 DNA Marker）購于TAKALA公司，T4 DNA連接酶購自MBI公司，胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂購于Oxiod公司；瓊脂糖購于Promega 公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside， IPTG）、氨芐青霉素（ampicillin， Amp）、卡那霉素（kanamycin， Kana）購于上海生工生物技術(shù)有限公司；小型質(zhì)粒抽提試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶Xba I和Nde I購于大連寶生物公司；蛋白質(zhì)Marker購于Solabio有限公司；DNA Marker 購于寶生物大連生物工程公司；四甲基二乙胺（TEMED）、考馬斯亮藍(lán)R-250、十二烷基磺酸鈉、丙烯酰胺、過硫酸銨（APS）、甘氨酸、溴酚藍(lán)（BPB）、Tris、甘油、醋酸、乙醇等其他生化試劑和常規(guī)試劑均為分析純。

2 方法

2.1 76肽的構(gòu)建與鑒定

在原有65P肽氨基酸序列的基礎(chǔ)上，連接TAT穿膜肽（YGRKKRRQRRR）使其能穿透細(xì)胞膜并在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[2]，對其蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，構(gòu)建76肽的初始三維結(jié)構(gòu)。借助生物信息學(xué)軟件Primer Premier 5.0的輔助下，合成含有SOD和GPx序列的76肽核苷酸序列， 并將原有非活性位點(diǎn)的半胱氨酸替換成其它氨基酸。

將合成得到的76肽核苷酸序列與pET22b質(zhì)粒利用T4 DNA連接酶在16℃條件下進(jìn)行過夜連接，構(gòu)建帶有76肽基因序列的重組載體pET22b-76P質(zhì)粒。采用CaCl2方法將重組載體轉(zhuǎn)入E.coli BL21（cysE51）感受態(tài)菌株中，轉(zhuǎn)入含有50 ?g/mL Kana的LB固體培養(yǎng)基中在37℃條件下培養(yǎng)10h進(jìn)行篩選，挑取單克隆在含有50 ?g/mL Kana的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，離心收集菌體沉淀提取pET22b-76P質(zhì)粒，采用NdeⅠ和XbaⅠ限制性核酸內(nèi)切酶對pET28b-76P質(zhì)粒在37 ℃下分別進(jìn)行單酶切和雙酶切4 h，再用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行酶切鑒定。

2.2 76肽的表達(dá)與條件優(yōu)化

將復(fù)制成功pET22b-76P質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于大腸桿菌E.coli BL21（cysE51）感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過培養(yǎng)和抗性篩選鑒定，篩選出陽性重組子。然后配制半胱氨酸營養(yǎng)缺陷型表達(dá)所需培養(yǎng)基，即采用Sec替代蛋白中的所有Cys，進(jìn)行Se-76P的表達(dá)[3]。通過優(yōu)化菌體培養(yǎng)濃度、Cys終濃度、IPTG誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間，IPTG誘導(dǎo)劑濃度梯度為千分之零點(diǎn)六、千分之零點(diǎn)八、千分之一、千分之一點(diǎn)二、千分之一點(diǎn)四，誘導(dǎo)溫度梯度為26℃、28℃、30℃、32℃，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間梯度為2h、3h、4h、5h、6h，先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，再進(jìn)行正交試驗(yàn)，最終確定最優(yōu)化的誘導(dǎo)表達(dá)條件，誘導(dǎo)表達(dá)出含硒76肽。SDS-PAGE鑒定含硒表達(dá)產(chǎn)物并用Ni2+離子螯合層析純化[4]，純化所用咪唑濃度梯度為50mM、100mM、150mM、300mM、500mM。最后用Western blotting鑒定[5]。利用試劑盒測定表達(dá)后的76肽的GPx和SOD活力。

3 結(jié)果分析

3.1 酶切鑒定結(jié)果

由限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XbaⅠ單、雙酶切后1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，單酶切得到一條明亮的條帶且與重組質(zhì)粒分子量大小一致，雙酶切得到兩條明亮的條帶，兩者之和等于重組質(zhì)粒的大小，由此可知pColdⅠ（sp-4）-76P質(zhì)粒構(gòu)建成功。

3.2 SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果

由SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1，見18頁）可知表達(dá)純化所得到的蛋白分子量大小與預(yù)期一致，誘導(dǎo)前無目標(biāo)條帶，誘導(dǎo)后可以看到明顯的目標(biāo)條帶，所以pET22b-76P質(zhì)粒在E.coli BL21（cysE51）感受態(tài)菌株中有較好表達(dá)并成功純化。

4 結(jié)論

本研究成功合成并表達(dá)了具有GPx和SOD雙酶活性的含硒抗氧化肽，通過一系列的研究獲得了此抗氧化肽的表達(dá)條件及生物信息學(xué)效應(yīng)，為此后進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Shin MC， Zhang J， Min KA， Lee K， Byun Y， David AE， He H， Yang VC. Cell-penetrating peptides：achievements and chal lenges in application for cancer treatment. J Biomed Mater Res A， 2014， 102（2）：575-587.

[2] Yan F， Yan GL， Lv SW， Shen N， Mu Y， Chen T， Gong PS， Xu YW， Lv LM， Liu JQ， Shen JC， Luo GM. Anovel 65-mer pep tide imitates the synergism of superoxide dismutase and gluta thione peroxidase[J]. Int J Biochem Cell Biol， 2011， 43： 1802- 1811.