駱瑩瑩，蒲位凌，郭傲瑋，白茹玉，史 紅，周 昆，高秀梅，孫力康

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 300193）

急性胰腺炎（AP）是一種常見的臨床急腹癥之一，病程變化多變，其近年來發(fā)病率有增多的趨勢。其炎癥過程是由于胰腺內(nèi)的胰蛋白酶被激活，導(dǎo)致腺泡細胞自身消化，從而使胰腺組織出現(xiàn)水腫，充血，出血甚至壞死等現(xiàn)象，在高科技發(fā)展的今天仍是死亡率高的常見急腹癥[1]。

血必凈注射液是在中醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下，以古方血府逐瘀湯為基礎(chǔ)精煉而出的靜脈注射劑，具有化瘀解毒的功效。有研究證實，血必凈注射液在體內(nèi)有拮抗內(nèi)毒素、抑制炎癥介質(zhì)、改善胰腺微循環(huán)等藥理作用[2]。目前，臨床上使用血必凈注射液治療胰腺炎[3]?，F(xiàn)研究表明血必凈注射液通過抑制炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α），白介素-1β（IL-1β）的釋放對胰腺炎產(chǎn)生治療作用[4]。故本研究對血必凈注射液治療AP小鼠的機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品、試劑與儀器 雨蛙素購買于上海翊圣（LOT：C07721）；血必凈注射液購買于天津紅日藥業(yè)股份有限公司（國藥準(zhǔn)字Z20040033）；淀粉酶試劑盒（C016）購買于南京建成生物研究所；MCP-1 ELISA試劑盒購買于Millipore公司（Cat:MCYTOMAG-70K）；兔抗小鼠多克隆抗體JNK（9252S），兔抗小鼠單克隆抗體p-JNK（81E11），兔抗小鼠單克隆抗體ERK1/2（137F5），兔抗小鼠單克隆抗體 p-ERK1/2（197G2），兔抗小鼠多克隆抗體 p38（9212S），兔抗小鼠單克隆抗體p-p38（12F8）均購買于CST；辣根酶lgG標(biāo)記山羊抗兔（H+L）購買于中衫金橋（ZB-2301）。BCA蛋白定量試劑盒（23227）購買于Thermo FisherScientific；QuickBlockTMWestern 封閉液（P0252）購買于碧云天生物技術(shù)公司；RIPAl組織裂解液（R0020）購買于北京索萊寶公司。4%多聚甲醛購買于天津康科德化學(xué)試劑公司；酶標(biāo)儀（Enspire）購買于美國PerkinElmer。離心機（Micro17）和離心機（Micro 21 R）購買于Thermo Fisher Scientific。多功能成像分析系統(tǒng)（MP5000）購買于BIO-RAD公司。

1.2 動物分組與造模 健康雄性小鼠C57BL/6J15只（許可證號：SCXK 京-2014-0004），8～10周，體質(zhì)量20～23 g，SPF級，購買于北京華阜康生物科技股份有限公司。以上動物均飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所。隨機分為3組，隨機分成3組（n=5）：對照組、AP模型組和血必凈治療組，且每組單籠飼養(yǎng)，實驗過程中正常飲水和飲食，室溫飼養(yǎng)。AP模型組和血必凈治療組均腹腔注射雨蛙素（50 μg/kg，每天5次，間隔1 h，注射3 d），血必凈治療組在每天注射第5次雨蛙素30 min后給予尾靜脈注射血必凈注射液（13 mL/kg），且每天注射1次。急性胰腺炎模型組給予尾靜脈注射同等劑量的生理鹽水。

1.3 標(biāo)本采集與檢測 造模結(jié)束24 h后，小鼠摘眼球取血至動物死亡，全血置于37℃水浴靜置1 h，使用離心機（Micro 17）轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，10 min后取血清，存放于-20℃冰箱留用。完整摘除胰腺，將胰腺一分為二，靠近脾部固定于4%多聚甲醛中，剩余部分放于凍存管中迅速置于液氮中，轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱長期凍存。

1.3.1 胰腺組織的病理學(xué)變化 固定于4%多聚甲醛中胰腺，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色法（HE），觀察胰腺組織的病理變化。

1.3.2 血清淀粉酶的檢測 采用碘與淀粉比色法，測定淀粉酶的活性。

1.3.3 ELISA法檢測胰腺組織中MCP-1表達 將-80℃冰箱中的胰腺組織取出置于盛有少量液氮研缽中，將組織研碎，加入RIPAl組織裂解液，混勻，使用離心機轉(zhuǎn)速為 12 000 g，10 min，4℃，離心取上清。采用BCA蛋白定量試劑盒將蛋白定量為2 μg/μL，用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋至總體積為50 μL。按照ELISA試劑盒方法測定胰腺組織中MCP-1表達。

1.3.4 Western blot法檢測胰腺組織中MAPK信號通路中相關(guān)蛋白表達 提取方法同1.3.3，蛋白定量的濃度為 4 μg/μL。按照 30 μg蛋白樣本/孔進行凝膠電泳，結(jié)束后轉(zhuǎn)移至用甲醇浸泡10 min的PVDF膜中，再全濕轉(zhuǎn)1 h；QuickBlockTM Western封閉液室溫封閉PVDF膜20 min，山羊抗兔lgGⅡ抗室溫孵育1.5 h，洗膜，加ELC發(fā)光劑在多功能成像分析系統(tǒng)進行曝光，并且對目的條帶進行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS軟件17.0進行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（x±SD）來表示。兩組之間的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 胰腺組織病理學(xué)改變 正常對照組小鼠胰腺組織HE染色在光鏡下未見病理學(xué)改變；AP模型組胰腺組織中腺泡細胞有大片空泡形成，水腫且細胞間距變大，炎細胞浸潤明顯，未見腺泡細胞壞死；血必凈治療組胰腺組織中可見有極少空泡形成，與模型組相比水腫較輕和細胞間距明顯減小，且均未炎細胞浸潤及壞死現(xiàn)象；胰腺組織損傷明顯改善。見圖1。

2.2 血清淀粉酶活性的變化 AP模型組血清淀粉酶的活性為（8 805.72±592.91）U/dL；與對照組小鼠（2 378.57±129.55）U/dL相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而血必凈治療組血清淀粉酶的活性為（2 024.43±465.86）U/dL，與AP模型組相比顯著下降（P＜0.05）。見圖 2。

2.3 胰腺組織中MCP-1表達變化 與對照組相比（9.59±0.49）pg/mL，AP 模型組（164.58±68.33）pg/mL胰腺組織中MCP-1表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；而血必凈治療組（5.95±1.46）pg/mL MCP-1表達顯著降低，與AP模型組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 3。

2.4 胰腺組織中MAPK信號通路中相關(guān)蛋白的表達 對照組、AP模型組和血必凈治療組中ERK1/2 MAPK與p-ERK1/2均未有明顯改變，且不具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）見圖 4（A、B）。與對照組相比，AP模型組中p-p38蛋白有明顯上調(diào)具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；而與血必凈治療組相比蛋白p-p38有顯著下調(diào)的趨勢（P＜0.05）。見圖 4（C）。

3 討論

AP作為一種臨床危重癥，在臨床上表現(xiàn)為腹痛、腹脹，并常伴有并發(fā)癥，其特點為病勢發(fā)展快、致死率高。近年來隨著人們生活水平的提高以及飲食習(xí)慣越來越不規(guī)律，其發(fā)病率逐年攀升[5]。

圖1 胰腺組織病理學(xué)改變（HE×200）

圖2 小鼠血清淀粉酶的變化

圖3 小鼠胰腺組織MCP-1表達變化

AP是由胰腺內(nèi)胰酶在腺泡細胞內(nèi)被激活，引起胰腺組織的自我消化，炎性介質(zhì)和自由基大量釋放，嚴重損傷胰腺組織，從而導(dǎo)致胰腺微循環(huán)功能障礙，嚴重時可致使全身炎癥反應(yīng)綜合征（SISRS）和多臟器功能不全（MODS）等病癥[6]。臨床上AP患者多以對癥治療為主，病情嚴重者采用手術(shù)、微創(chuàng)等干預(yù)措施[7]。近年來，臨床AP治療中常在西醫(yī)常規(guī)治療基礎(chǔ)上使用血必凈注射，效果顯著[3,8]。血必凈注射液是根據(jù)“三證三法”的辨證原則和“菌、毒、炎”理論，在古方血府逐瘀湯的基礎(chǔ)上研制的靜脈注射制劑，主要由赤芍、川芎、丹參、紅花、當(dāng)歸等5種中藥組成，其藥效為活血化瘀，清熱解毒[9]。適用于因感染引起的全身炎癥綜合征，也可用于配合治療多器官功能失常綜合征的臟器功能受損期。方中芍藥苷[10]、川芎嗪[11]、隱丹參酮與丹參酮ⅡA[12]、阿魏酸[13]和紅花黃色素[14]是其主要有效成分，均發(fā)揮抗炎、抗氧化、抑制氧自由基等藥理作用。研究表明，血必凈注射液具有降低炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激以及調(diào)節(jié)免疫功能等藥理作用[15]。因此，本實驗對血必凈注射液治療雨蛙素誘導(dǎo)的AP小鼠的作用機制進行探討。

圖4 MAPK信號通路中相關(guān)蛋白的表達

表1 各組指標(biāo)結(jié)果

本研究采用雨蛙素高劑量多次腹腔注射復(fù)制出小鼠AP模型，其模型組小鼠胰腺組織中腺泡細胞出現(xiàn)空泡現(xiàn)象即早期的腺泡細胞水腫，腺泡細胞間隙變大為較重水腫現(xiàn)象，更為嚴重的現(xiàn)象是細胞間質(zhì)有炎細胞浸潤并伴有出血現(xiàn)象。在本研究中，胰腺組織HE染色結(jié)果提示，AP模型組胰腺組織腺泡細胞水腫、細胞間距變大，炎細胞浸潤較多；血必凈治療組胰腺組織細胞水腫較輕、炎細胞浸潤較少（圖1），證實血必凈注射液可以修復(fù)雨蛙素誘導(dǎo)的AP小鼠胰腺組織損傷。

AP臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)為血清淀粉酶水平。在本研究中，與對照組相比，AP模型組血清淀粉酶的活性顯著升高，表明小鼠腺泡細胞內(nèi)酶原被激活，引起腺泡細胞受損，從而使小鼠表現(xiàn)為AP。與AP模型組相比，血必凈治療組血清淀粉酶活性顯著降低，提示血必凈注射液對小鼠AP有治療作用（圖2）。相關(guān)動物研究提示，MCP-1是由單核巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞合成的堿性蛋白[16]，在受損的組織中對巨噬細胞聚集有著重要作用[17]，且作為炎癥級聯(lián)反應(yīng)的始動因子，是早期AP重要炎癥介質(zhì)之一。本研究結(jié)果顯示，同對照組相比，AP模型組胰腺組織MCP-1蛋白水平顯著升高，提示在雨蛙素誘導(dǎo)的AP小鼠中，腺泡細胞內(nèi)炎癥級聯(lián)反應(yīng)已被激活。與AP模型組相比，血必凈治療組中MCP-1表達明顯降低（圖3），提示血必凈注射液對AP的早期炎癥反應(yīng)有明顯抑制作用。研究顯示，在胰腺腺泡細胞中核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）的亞單位p65是p38MAPK的靶點[18]，p38MAPK在AP小鼠胰腺腺泡細胞炎癥反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用[19]。為進一步闡明血必凈注射液保護胰腺組織的機制，本文針對絲裂原活化蛋白激酶信號傳導(dǎo)通路進行研究，結(jié)果顯示，正常對照組、AP模型組和血必凈治療組中蛋白水平ERK1/2、JNK無顯著性差異，因此證實血必凈注射液對雨蛙素誘導(dǎo)的AP腺泡細胞在MAPK信號通路ERK1/2、JNK蛋白無調(diào)節(jié)作用；而AP模型組，p-p38/p38明顯升高，表明雨蛙素誘導(dǎo)的AP模型激活了p38MAPK信號通路，血必凈治療組p-p38/p38顯著下調(diào)，說明血必凈注射治療雨蛙素誘導(dǎo)的AP可能是通過抑制p38MAPK蛋白表達，從而阻斷炎癥反應(yīng)，并使胰腺損傷組織得到修復(fù)（圖4 A、B、C）。

綜上所述，本研究表明血必凈注射液對雨蛙素誘導(dǎo)AP作用機制可能是抑制p38MAPK信號通路，從而調(diào)節(jié)下游蛋白MCP-1等趨化因子而達到保護小鼠AP的作用。