向琴，高柳，車振明，劉平，林俊帆，李之友

(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都，610039)

花椒油(pepper oil)是從花椒中提取呈香、呈味物質(zhì)于食用植物油中混合均勻的產(chǎn)品，與食用油類似，易受氧、水、光、熱、微生物等的影響而發(fā)生水解或氧化酸敗，產(chǎn)生異臭和異味，嚴(yán)重的甚至形成有毒物對人體造成危害[1]。目前，通常采用感官評價和理化檢測(如酸值、過氧化值測定)來辨別花椒油的氧化變質(zhì)。感官評價法直觀、易實施、無需成本，但主觀性較強(qiáng)、誤差較大、重復(fù)性也較差[2]；理化檢測法準(zhǔn)確度較高、成本也較低，但耗時較長、需專業(yè)檢測人員。故而，找到一種簡便、準(zhǔn)確度高、省時省力的檢測方法迫在眉睫，同時有助于促進(jìn)花椒油市場的規(guī)范化。而電子鼻是一種快速有效的檢測方式，具有客觀性強(qiáng)、測定速度快、操作簡單、重現(xiàn)性良好、樣品無需復(fù)雜前處理等優(yōu)點。利用電子鼻既能分析痕量氣味物質(zhì)，對樣品間氣味相似度進(jìn)行簡單比較；也能通過預(yù)先采集標(biāo)準(zhǔn)樣品建立相應(yīng)數(shù)據(jù)庫，進(jìn)而對未知樣品進(jìn)行預(yù)測和評判，尤其對氣味成分復(fù)雜或存在氣味協(xié)同作用的樣品具有良好的監(jiān)測作用。目前，電子鼻技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)醫(yī)藥、食品和農(nóng)產(chǎn)品，尤其在質(zhì)量評價[3-4]、霉變研究[5]、產(chǎn)地及種類鑒別[6-8]、真?zhèn)舞b別[9-10]、等級鑒定[11-12]、食品過程監(jiān)控[13-14]、不同處理時間或條件下的成熟過程[15-17 ]或貯藏效果[18-23]等方面研究較多。

本研究以市場上較常見的10種花椒油為研究對象，采用電子鼻技術(shù)測定花椒油的氣味變化，同時結(jié)合聚類分析(CA)、主成分分析(PCA)、線性判別分析(LDA)和判別因子分析(DFA)對不同氧化程度的花椒油進(jìn)行定性判別分析，并建立花椒油氧化的快速判別模型，同時檢測判別結(jié)果與理化指標(biāo)進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

川老匯花椒油，四川高福記食品有限公司；幺麻子藤椒油，四川洪雅縣幺麻子食品有限公司；五豐黎紅花椒油，四川五豐黎紅食品有限公司；建華花椒油，四川成都建華食品有限公司；牛市破花椒油，四川省漢源大自然有限公司；九斗碗特麻花椒油，成都寶陽味業(yè)有限責(zé)任公司；陳麻婆藤椒油，成都陳麻婆川菜調(diào)味品有限公司；金龍魚花椒油，嘉里糧油四川有限公司；長康花椒油，湖南省長康實業(yè)有限責(zé)任公司；濤胖花椒油，洪雅縣興江食品專業(yè)合作社。以上油樣基本涵蓋四川地區(qū)常見的花椒油種類，且生產(chǎn)日期均控制在距離實驗日期10 d范圍內(nèi)，保證了油脂的新鮮程度。

三氯甲烷、冰乙酸、KI、Na2SO3、可溶性淀粉、異丙醇、乙醚、百里香酚酞與NaOH(均為分析純),成都科龍試劑化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

PEN3電子鼻，德國Airsense公司，傳感器陣列是由10個不同的金屬氧化物傳感器組成[24-25]，見表1，不同傳感器響應(yīng)不同氣味物質(zhì)。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

取10種花椒油油樣，置于105 ℃烘箱中進(jìn)行快速氧化1.5 h[26]，并采用國標(biāo)法對處理后的樣品進(jìn)行酸值和過氧化值的測定，根據(jù)測定結(jié)果將樣品明確地分為已氧化和未氧化2個階段，共得到50個不同氧化程度的的樣品。

1.3.2 氧化程度指標(biāo)測定

為確定花椒油樣品的氧化程度，采用GB5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》[27]和GB5009.229—2016《食品中酸價的測定》[28]對花椒油樣品的過氧化值和酸值進(jìn)行測定。根據(jù)GB 2716—2005《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[29]的規(guī)定，花椒油氧化標(biāo)準(zhǔn)如下：未氧化油的過氧化值≤0.25 g/100 g且酸值≤3 mg/g；氧化油的過氧化值>0.25 g/100 g或酸值>3.00 mg/g。

1.3.3 氣體采集及測定條件

1.3.3.1 分析條件的選擇

對比分析不同水浴溫度和水浴平衡時間對傳感器響應(yīng)強(qiáng)度的影響，選取新鮮川老匯花椒油樣品(樣品1)為實驗對象，準(zhǔn)確量取3 mL置于50 mL樣品瓶中，立即蓋上瓶蓋，水浴平衡一段時間后進(jìn)行電子鼻分析，平衡溫度梯度25、35、45、55 ℃，平衡時間梯度2、4、6、8 min，每個梯度平行測定5次。

1.3.3.2 氣體采集

準(zhǔn)確量取樣品3 mL于50 mL樣品瓶中，根據(jù)1.3.3.1中優(yōu)化的分析條件，采用頂空吸氣法，直接將進(jìn)樣針頭插入樣品瓶，完成一次檢測后待系統(tǒng)進(jìn)行清零和標(biāo)準(zhǔn)化，然后再進(jìn)行第2次頂空采樣，每個樣品平行測定5次。

1.3.3.3 電子鼻檢測條件

樣品準(zhǔn)備時間5 s，檢測時間200 s，測量計數(shù)1 s，自動調(diào)零時間5 s，清洗時間100 s，內(nèi)部流量400 mL/min，進(jìn)樣流量8 mL/min。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

對傳感器采集的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用Alpha-so 軟件和SPSS 20.0提供的CA、PCA、LDA、ANOVA等多種方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，建立花椒油氧化與否的快速判別模型，并利用DFA法對未知樣品進(jìn)行快速判別。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品氧化程度分布結(jié)果分析

根據(jù)1.3.2中國標(biāo)對100組模型集樣品以及40組驗證集樣品的過氧化值和酸值進(jìn)行測定，氧化程度如表2所示。

表2 樣品氧化程度分布Table 2 Distribution of oxidation degree in sample

根據(jù)GB 2716—2005的規(guī)定，當(dāng)過氧化值>0.25 g/100 g或酸值>3.00 mg/g時則判定樣品發(fā)生氧化。由表2可知，當(dāng)樣品過氧化值處于0.25～0.35 g/100g時，其酸值<3.00 mg/g，即以過氧化值為判定依據(jù)則樣品處于氧化狀態(tài)，而以酸值為判定依據(jù)則樣品仍處于非氧化狀態(tài)。由此可知，采用過氧化值這個指標(biāo)來判定花椒油氧化較為嚴(yán)格，因此，本實驗以過氧化值為主、酸值為輔來判定樣品的氧化程度。

2.2 氣體采集條件分析

根據(jù)1.3.3.1測定結(jié)果，得到不同水浴溫度、不同水浴平衡時間的電子鼻傳感器響應(yīng)如圖1、圖2所示。

石愛華等[30]對花椒油中的化學(xué)成分進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果表明,花椒油中的揮發(fā)性成分多為烯烴、醇類等分子質(zhì)量較小的化合物，還包括少量的酯類、醇類、酮類化合物，它們在常溫下易揮發(fā)，如α-水芹烯、2-蒎烯、檜烯、β-月桂烯、大根香葉烯、α-檸檬烯、萜品油烯、別羅勒烯、β-欖香烯、芳樟醇、4-萜烯醇、乙酸芳樟酯、乙酸苯乙酯、 4-甲基-2-戊酮等。

圖1 不同溫度下電子鼻的傳感器響應(yīng)(樣品1)Fig.1 Sensor responses of E-nose at different temperatures (sample 1)

圖2 不同平衡時間下電子鼻的傳感器響應(yīng)(樣品1)Fig.2 Sensor responses of E-nose under different equilibrium time(sample 1)

由圖1可知，隨著樣品平衡溫度的上升，R1、R3、R4、R5、R8和R10傳感器響應(yīng)強(qiáng)度幾乎相等，R2、R6、R7和R9傳感器響應(yīng)強(qiáng)度緩慢上升，且45 ℃下的傳感器響應(yīng)強(qiáng)度和55 ℃下得傳感器強(qiáng)度幾乎相等，這與石愛華的研究結(jié)論相符，但45 ℃下的傳感器響應(yīng)強(qiáng)度的誤差遠(yuǎn)小于55 ℃，說明45 ℃條件下樣品頂空氣體的穩(wěn)定性更好，實驗的重現(xiàn)性更好，平行組樣品強(qiáng)度響應(yīng)值差異也較小，故本實驗選擇水浴平衡溫度為45 ℃。

由圖2可知，隨著水浴平衡時間的增長，各傳感器響應(yīng)強(qiáng)度的差異并不明顯，基本接近，故主要考慮測定的穩(wěn)定性，當(dāng)平衡時間為4 min時，傳感器響應(yīng)強(qiáng)度的誤差最小，故本實驗選擇水浴平衡時間為4 min。

2.3 樣品傳感器信號分析

隨機(jī)抽取川老匯的氧化油樣與未氧化油樣進(jìn)行電子鼻特征分析，得到相應(yīng)的傳感器信號響應(yīng)強(qiáng)度如圖3、圖4所示。

圖3 未氧化花椒油傳感器響應(yīng)強(qiáng)度Fig.3 Sensor responses intensity of non-oxidized pepper oil

圖4 氧化花椒油傳感器響應(yīng)強(qiáng)度Fig.4 Sensor responses intensity of oxidized pepper oil

圖3、圖4中每條曲線代表各傳感器對該樣品揮發(fā)性成分的相對電導(dǎo)率隨時間的變化情況，相對電導(dǎo)率值越偏離1(大于或者小于1)，表明響應(yīng)氣體質(zhì)量濃度越大；如果質(zhì)量濃度低于檢測限或未感應(yīng)到氣體，相對電導(dǎo)率則接近于1[26]。由圖3和圖4可知，進(jìn)樣后，揮發(fā)性成分被傳感器吸附，相對電導(dǎo)率隨之發(fā)生改變，電子鼻10 個傳感器的響應(yīng)值先逐漸上升，然后趨于平穩(wěn)，并在140 s后基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，因此實驗選取141～145 s內(nèi)的平均響應(yīng)值作為特征值分析。

不同傳感器對油樣的響應(yīng)強(qiáng)度不同，R2、R6、R7和R10傳感器的響應(yīng)較大，其余傳感器響應(yīng)較小，說明花椒油中的主要揮發(fā)性成分為氮氧化合物、烷烴類以及含硫化合物。對比氧化油樣與未氧化油樣的響應(yīng)信號，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在顯著差異：R7傳感器對2種油樣的響應(yīng)強(qiáng)度均較高，且未氧化花椒油的響應(yīng)值更高；在R2傳感器上氧化油樣的響應(yīng)強(qiáng)度明顯高于未氧化油樣，而在R10傳感器上的強(qiáng)度明顯低于未氧化油樣，由此說明氧化油樣與未氧化油樣的揮發(fā)性成分存在顯著差異，可以利用電子鼻進(jìn)行區(qū)分。

2.4 CA分析

在解決實際問題過程中，對多個樣本進(jìn)行分類時，依據(jù)單因素分類往往不夠全面、綜合的描述其類別，因此需考慮多方面因素進(jìn)行分類。CA分析是一種對研究對象或指標(biāo)的諸多特性進(jìn)行分類的方法，它將樣品按照某種特性的相似程度逐漸聚合在一起，相似度最大的優(yōu)先聚合在一起，最終按照類別的綜合性質(zhì)多個品種聚合，從而完成聚類分析的過程[31]。

本研究選取10個傳感器141～145 s內(nèi)響應(yīng)強(qiáng)度的平均值為特征值進(jìn)行分析，將所有數(shù)據(jù)點輸入SPSS 20.0，采用離差平方和法(Ward法)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，并以平方歐氏距離為度量標(biāo)準(zhǔn)[26]對模型集中100個實驗油樣進(jìn)行CA分析，得到樹狀圖如圖5所示。

圖5 氧化與未氧化花椒油揮發(fā)性物質(zhì)聚類分析(CA)Fig.5 Clustering analysis of volatile compounds in oxidized and non-oxidized pepper oils

最小距離水平上，所有樣品總共形成了5個小類，每一小類所包含的樣品之間具有極大的相似性。隨著歐式距離的增大，第2小類和第3小類繼續(xù)聚為一類，第4小類和第5小類繼續(xù)聚為一類。當(dāng)歐氏距離增至5時，第1小類才聚入第2小類、第3小類，說明第1小類所包含的樣品與第2小類、第3小類所包含的樣品在揮發(fā)性風(fēng)味特性上具有一定的相似性，而與第4小類和第5小類所包含樣品相似性較差。由圖5可明顯看出，100個模型集樣品明顯聚為兩類，對比樣品國標(biāo)法所測得的過氧化值和酸值，聚類結(jié)果與國標(biāo)法測定結(jié)果相一致。由此可知，利用電子鼻結(jié)合CA分析法可以對花椒油氧化進(jìn)行判別。

2.5 PCA分析

PCA分析是降低數(shù)據(jù)維度和解決多重共線性問題最常用的多變量統(tǒng)計方法之一。該方法簡化了獲取樣品信息的任務(wù)，采用非監(jiān)督式的投影方法，通過對原始變量的不相關(guān)和線性組合形成新變量來整合數(shù)據(jù)。通常，這些新變量(稱為主要組件(PC))能夠解釋整個數(shù)據(jù)中絕大多數(shù)變量，即僅考慮幾個新變量就能將高維數(shù)據(jù)以最小的信息損失降低到更低的維度[32]。因此，該法常用于獲取復(fù)雜樣品的數(shù)據(jù)信息和對高維度數(shù)據(jù)信息進(jìn)行降維。

為了更有效地區(qū)分氧化油樣和未氧化油樣，本研究采用降維的PCA分析法對樣品進(jìn)一步分析以期望達(dá)到更好的分離效果。根據(jù)電子鼻響應(yīng)信號，對10個傳感器的響應(yīng)值進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖6所示。

圖6 氧化花椒油與非氧化花椒油樣的主成分分析(PCA)Fig.6 Principal component analysis of oxidized and non-oxidized pepper oils

由圖6可知，PC1的方差貢獻(xiàn)率為92.65%，PC2的方差貢獻(xiàn)率為6.91%，PC1和PC2的總貢獻(xiàn)率達(dá)99.561%>85%，說明前2個主成分足以代表油樣的整體信息，PCA分析結(jié)果有效。所有樣品被分成兩簇，且兩簇之間明顯區(qū)分開，說明氧化油樣與未氧化油樣的風(fēng)味差異較大，能夠被電子鼻區(qū)分，區(qū)分結(jié)果與國標(biāo)測定的結(jié)果相一致。因此，利用電子鼻結(jié)合PCA分析法可以辨別花椒油氧化與否。

2.6 LDA分析

LDA能夠?qū)維數(shù)據(jù)投影到低維空間，使投影后組與組之間盡可能分開，以最大的組間距離和最小的組內(nèi)距離為衡量標(biāo)準(zhǔn)來判斷樣品的可分離性[33]。將模型集樣品傳感器在141～145 s的響應(yīng)平均值作為特征值，通過LDA分析法進(jìn)行分析，如圖7所示。

圖7 氧化花椒油與未氧化花椒油的線性判別分析(LDA)Fig.7 Linear discriminant analysis of oxidized and non-oxidized pepper oils

由圖7可知，LD1方差貢獻(xiàn)率為47.72%，LD2方差貢獻(xiàn)率為6.61%，總貢獻(xiàn)率達(dá)到54.33%。總貢獻(xiàn)率相對較小，但2種油樣的組間差異明顯增大，組內(nèi)差異明顯減小。通過對驗證集樣品的判別，所有油樣均能成功，因此，LDA分析法也可以作為花椒油氧化與否的判別方式之一。

2.7 DFA分析

DFA分析是一種基于數(shù)據(jù)演繹的分類方法。與PCA分析不同，它是一種監(jiān)督式的分類方法，通過估算不同類別之間的邊界值，使得類別之間的方差最大化，并且各類中的方差最小化。因此，線性組合最大化了這些維度的貢獻(xiàn)，進(jìn)而使得預(yù)測組之間產(chǎn)生最大化的差異，使用該方法可以根據(jù)不同的屬性對同一數(shù)據(jù)集進(jìn)行不同的分類[32]。

2.7.1 全變量DFA模型分析

將模型集樣品的所有傳感器響應(yīng)值數(shù)據(jù)進(jìn)行DFA分析，并建立相應(yīng)的DFA模型，并對40組驗證集樣品進(jìn)行隨機(jī)編號U1～U40，利用DFA模型進(jìn)行驗證，若分組結(jié)果與國標(biāo)測定一致，則顯示為yes，否則顯示為no，判別率結(jié)果見表3。

表3 驗證集油樣的判別結(jié)果Table 3 Identification results of the validation set in pepper oil samples

由表3可知，利用模型集樣品的傳感器響應(yīng)值進(jìn)行DFA建模，所建模型對40組未知樣品的識別效果較差，且對未知樣品U2、U8、U15、U19、U24、U30、U33、U37和U40識別錯誤，結(jié)合該9種油樣的過氧化值，分別為0.254、0.249、0.251、0.245、0.223、0.255、0.248、0.252、0.246 g/100 g，由此可知利用所有傳感器響應(yīng)數(shù)據(jù)所建DFA模型對氧化臨界值附近的樣品判別效果較差，因此，有必要對10個傳感器進(jìn)行優(yōu)化。

2.7.2 傳感器優(yōu)化DFA分析

方差分析(ANOVA分析)，又稱“變異數(shù)分析”或“F檢驗”，是用于2個及2個以上樣本均數(shù)差別的顯著性檢驗，方差分析的目標(biāo)為經(jīng)過數(shù)據(jù)分析判斷敏感因素、因素間的相互影響以及敏感因素的最佳值等[34]，其結(jié)果常以F值和p值的大小來表示。與給定顯著水平的標(biāo)準(zhǔn)F值相比較，若F值越大，說明處理之間效果或差異越明顯；若F值越小，說明試驗精度越高。

以模型集20組樣品(每組樣品5次平行)的傳感器響應(yīng)值為研究對象，利用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)來優(yōu)選傳感器，結(jié)果見表4。最終選擇F值>120的傳感器為DFA建模的最優(yōu)傳感器，即以W5S、W1W、W2W和W3S等4根傳感器為優(yōu)選傳感器。

表4 傳感器響應(yīng)方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results of the sensor respondsin pepper oil samples

利用以上述優(yōu)選傳感器重新對模型集樣品進(jìn)行DFA分析，并以2.7.1中識別錯誤的9個樣品以及隨機(jī)抽取的1個樣品作為驗證集，依次編號XU1～XU10，并對新建模型進(jìn)行驗證，結(jié)果見表5。

表5 10個未知樣品的判別結(jié)果Table 5 Identification results of 10 unknown pepper oilsamples

由表5可知，采用優(yōu)選傳感器建立的DFA模型，10個未知樣本均落在相應(yīng)的組別，判別效果良好，判別正確率均大于96%。因此，利用電子鼻的優(yōu)選傳感器結(jié)合DFA法能夠有效判別花椒油樣品氧化與否，且可行性較高。

2.8 模型驗證結(jié)果

為了進(jìn)一步驗證本實驗所建花椒油氧化快速模型的可靠性，利用CA、PCA、LDA和DFA所建模型對未參與建模的40個驗證樣品進(jìn)行判別分析，并計算判別正確率：判別正確率=判斷正確個數(shù)÷總的判斷次數(shù)，其結(jié)果見表6。

表6 盲樣的CA、PCA、LDA和DFA的驗證結(jié)果Table 6 Validation results of CA，PCA，LDA and DFA inunknown pepper oil samples

由表6可知，當(dāng)40組驗證樣品經(jīng)CA時，有1個未氧化和1個已氧化錯誤，與國標(biāo)方法判定結(jié)果不一致，對應(yīng)的過氧化值分別為0.230、0.270 g/100 g，均在臨界值附近，與標(biāo)準(zhǔn)相差較?。唤?jīng)PCA時，僅有1個未氧化樣品錯誤，其過氧化值為0.24 g/100 g，處于未氧化狀態(tài)，造成錯誤的原因在于接近氧化臨界值(0.25 g/100 g)較接近，使得模型誤判；經(jīng)LDA時，所有驗證集樣品均正確，與國標(biāo)判定結(jié)果一致；經(jīng)DFA時，有2個未氧化油樣和1個已氧化油樣錯誤，與國標(biāo)判定結(jié)果不一致。

綜上所述，電子鼻技術(shù)結(jié)合CA、PCA、LDA和DFA分析法基本能有效花椒油氧化與否，且LDA法的效果最穩(wěn)定，能夠有效地避免主觀因素對結(jié)果的影響，同時克服了傳統(tǒng)理化方法的缺點，達(dá)到了快速檢測的目的。

3 結(jié)論

利用電子鼻技術(shù)對花椒油的氣味成分進(jìn)行了分析，確定了花椒油中的揮發(fā)性物質(zhì)主要為氮氧化合物、烷烴類以及含硫化合物等。結(jié)合CA、PCA、LDA、DFA等分析方法建立了花椒油氧化的快速模型，并對模型進(jìn)行了驗證，判別正確率分別為95.0%、97.25%、100%，97.50%。因此，CA、PCA、LDA、DFA分析法均能有效花椒油氧化與否，且LDA法效果較好。