馬欣,古紹彬,2,3*,吳影,2

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽，471023)2(食品加工與安全國家級實驗教學(xué)示范中心，河南 洛陽，471023) 3(洛陽市微生物發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽，471023)

南瓜(Cucurbitamoschata)是葫蘆科(Cucurbitaceae)南瓜屬，1年生雙子葉蔓性草本植物，又稱倭瓜、金冬瓜等。南瓜營養(yǎng)成分豐富且全面，在三大產(chǎn)熱營養(yǎng)素中，以碳水化合物為主，且脂肪含量較低[1]。此外還含果膠、纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)、β-胡蘿卜素、礦物質(zhì)、戊聚糖、甘露醇、腺嘌呤、南瓜多糖及多種氨基酸等成分[2-5]。

據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織FAOSTAT數(shù)據(jù)顯示，2014年我國肉用南瓜生產(chǎn)面積80萬公頃左右，總產(chǎn)量超過2 900萬t，居世界第一，然而利用率卻極低，產(chǎn)業(yè)鏈不長，這不僅嚴重制約了我國南瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，還導(dǎo)致了資源的極大浪費[6]。目前，果蔬型發(fā)酵飲料由于綜合了果蔬汁和乳酸發(fā)酵的優(yōu)點，在歐美、日本等發(fā)達國家廣受歡迎，得到廣泛研究與開發(fā)[7]。因此，以南瓜為原料，以我國衛(wèi)計委新批準的人用益生凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)和健康三益菌之一的干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)為發(fā)酵劑，研制發(fā)酵型南瓜飲料，不僅能為南瓜資源的綜合利用提供有力支撐，還可豐富國內(nèi)活菌飲料產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蜜本南瓜，采購于當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場；凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)CGMCC 9951和干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)LC102為本實驗室保藏菌種。

β-胡蘿卜素標準品，北京索萊寶科技有限公司；生理體液氨基酸、蛋白水解氨基酸標準品，德國Membra Pure公司；所有分離用有機試劑均為國產(chǎn)分析純；纖維素酶，酶活單位50 000 U/g，果膠酶，酶活單位20 000 U/g，葡萄糖淀粉酶，酶活單位100 000 U/g 3種酶均購于上海藍季科技發(fā)展有限公司。

1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；A300型全自動氨基酸分析儀，德國Membra Pure公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化及種子制備

將凝結(jié)芽孢桿菌接種于改良LB培養(yǎng)基中，37 ℃，230 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)18 h；將干酪乳桿菌接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)18 h。

1.2.2 發(fā)酵型南瓜飲料制備工藝流程及操作要點

選用肉質(zhì)橘黃、無病蟲腐蝕的成熟南瓜為原料，清凈后除去表皮及種籽，將瓜肉處理為0.5 cm厚度的瓜片，并置于沸水中熱燙5 min，使組織充分軟化。軟化后按料水比1∶2(g∶mL)加水打漿，添加1.8%纖維素酶、0.3%果膠酶、0.25%葡萄糖淀粉酶于南瓜汁中，50 ℃水浴酶解3 h[8]。酶解完成后于100 ℃滅菌10 min[9]，冷卻至室溫然后接種發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后于4 ℃冰箱冷藏保存。

1.2.3 南瓜汁中凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵特性研究

將凝結(jié)芽孢桿菌以3%(活菌數(shù)約為1×107CFU/mL)的接種量添加到經(jīng)前處理的南瓜汁中，于37 ℃，230 r/min培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣監(jiān)測發(fā)酵南瓜汁中菌落總數(shù)、pH、可滴定酸及還原糖等的變化。

1.2.4 凝結(jié)芽孢桿菌和干酪乳桿菌偶聯(lián)發(fā)酵工藝

以上述凝結(jié)芽孢桿菌單菌發(fā)酵特性研究為基礎(chǔ)，以干酪乳桿菌接種量、偶聯(lián)發(fā)酵時間、偶聯(lián)發(fā)酵溫度為影響因素，考察各因素對菌落總數(shù)的影響，確定各個影響因素的范圍，以發(fā)酵南瓜飲料的活菌總數(shù)為響應(yīng)值，通過Box-Behnken試驗設(shè)計對偶聯(lián)發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。

1.3 發(fā)酵過程參數(shù)的測定

凝結(jié)芽孢桿菌、干酪乳桿菌活菌總數(shù)測定：平板稀釋活菌計數(shù)法?；罹倲?shù)：凝結(jié)芽孢桿菌與干酪乳桿菌活菌總數(shù)之和；pH測定：采用PH400基礎(chǔ)型臺式pH計；可滴定酸度測定：用已標定的0.1 mol/L/NaOH標準溶液進行酸堿滴定；還原糖測定：采用DNS法測定還原糖含量[10]；南瓜粗多糖：熱水浸提法[11]；多酚含量：福林酚試劑法[12]；Vc含量：2，6-二氯酚靛酚滴定法[13]。

β-胡蘿卜素：高效液相色譜法[14]。色譜條件：色譜柱：ZORBAX SB-C18250 mm×4 mm,5 μm。流動相A: 甲醇，流動相 B：乙酸乙酯。洗脫順序：0～20 min，90%～85%A;20～30 min，85%～70%A。柱溫：25 ℃，檢測波長：450 nm，流速：1.2 mL/min，進樣量：10 μL。

氨基酸含量測定：高效陽離子交換色譜(HPCEC)-柱后茚三酮衍生化法[15]，鋰鹽體系同時測定游離氨基酸與水解氨基酸，進樣量20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶添加對南瓜汁出汁率和還原糖含量的影響

南瓜中碳水化合物占南瓜干物質(zhì)量的60%左右，果膠約占10%～15%，纖維素約占10%。為提高南瓜的出汁率和南瓜汁的可發(fā)酵性，本研究在單一酶添加量的基礎(chǔ)上，即1.8%纖維素酶，0.3%果膠酶，0.25%葡萄糖淀粉酶，采用兩兩組合和三三組合進行復(fù)合酶解試驗。結(jié)果如圖1所示，復(fù)合酶處理可以顯著提高南瓜出汁率和還原糖含量，其中三酶復(fù)合酶解時，還原糖含量和出汁率分別達到22.78 g/L和85.45%，較未酶解南瓜汁的還原糖含量和出汁率有顯著提高。

1-未酶解南瓜汁；2-纖維素酶；3-果膠酶；4-糖化酶；5-果膠酶+纖維素酶；6-果膠酶+糖化酶；7-纖維素酶+糖化酶；8-纖維素酶+糖化酶+果膠酶圖1 復(fù)合酶對還原糖含量及出汁率的影響Fig.1 Effect of complex enzymes on reducing sugar content and juice yield

2.2 復(fù)合益生菌發(fā)酵南瓜飲料工藝研究

2.2.1 凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵特性研究

將活化后的凝結(jié)芽孢桿菌接種于經(jīng)酶解滅菌后的南瓜汁中。如圖2所示，在前4 h菌體處于適應(yīng)期，生長緩慢，還原糖消耗較低，隨著進入對數(shù)生長期，菌體密度迅速增長，培養(yǎng)基中還原糖含量持續(xù)下降，當培養(yǎng)到16 h時，菌體密度接近最大值，達到6.5×108CFU/mL。此后，盡管培養(yǎng)基中還含較多的還原糖，但2 h后活菌數(shù)仍開始緩慢下降，這可能是由于隨著發(fā)酵時間延長，菌體利用南瓜汁中糖代謝產(chǎn)生了包括L-乳酸在內(nèi)的大量有機酸[16]，從而導(dǎo)致了發(fā)酵醪中pH急劇下降，在10 h時pH值已降為4.27，可滴定酸達到了0.54%(見圖3)。

圖2 凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵過程中活菌數(shù)及還原糖的變化Fig.2 Changes of viable count and reducing sugar in fermentation of Bacillus coagulans

圖3 凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵過程中pH及可滴定酸的變化Fig.3 Changes of pH and titratable acid during fermentation of Bacillus coagulans

2.2.2 干酪乳桿菌發(fā)酵特性研究

將活化后的干酪桿菌接種于經(jīng)酶解滅菌后的南瓜汁中，可觀察到類似于凝結(jié)芽孢桿菌的曲線(見圖4)，至發(fā)酵后期，pH降至3.3左右，可滴定酸含量達到1.2%(見圖5)，說明其產(chǎn)酸能力明顯強于凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951。因此為保證發(fā)酵型南瓜飲料中有足夠的凝結(jié)芽孢桿菌的活菌數(shù)，擬采用兩菌偶聯(lián)發(fā)酵工藝，即先接種凝結(jié)芽孢桿菌，待前者生長到對數(shù)生長后期后，再接種干酪乳桿菌。為此，本文進行了干酪乳桿菌接種量、偶聯(lián)發(fā)酵時間、偶聯(lián)發(fā)酵溫度等對活菌總數(shù)影響的相關(guān)研究。

圖4 干酪乳桿菌發(fā)酵過程中活菌數(shù)及還原糖的變化Fig.4 Changes of viable count and reducing sugar in Fermentation of Lactobacillus casei

圖5 干酪乳桿菌發(fā)酵過程中pH及可滴定酸的變化Fig.5 Changes of pH and titratable acid in Fermentation of Lactobacillus casei

2.2.3 偶聯(lián)發(fā)酵單因素試驗

2.2.3.1 干酪乳桿菌接種量對活菌總數(shù)的影響

接種量對菌體的生長繁殖影響顯著，尤其在耦合發(fā)酵工藝中，后續(xù)接種的微生物，其接種量更是影響發(fā)酵能否成功的關(guān)鍵。研究結(jié)果如圖6所示，活菌總數(shù)隨著接種量的增加，呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。當接種量大于3%時，活菌總數(shù)明顯下降，這主要由于接種量增加，導(dǎo)致了干酪乳桿菌早期快速生長繁殖，引起發(fā)酵液中產(chǎn)酸量急劇增加，一方面導(dǎo)致菌體生長代謝被抑制，另一方面也誘發(fā)部分菌體出現(xiàn)自溶和衰退現(xiàn)象[17]。因此干酪乳桿菌最適接種量為3%(V/V)，此時活菌總數(shù)為2.23×109CFU/mL，凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)為1.67×109CFU/mL。

圖6 不同接種量對活菌總數(shù)的影響Fig.6 Effects of different inoculation amount on total viable count注：偶聯(lián)發(fā)酵時間為6 h，偶聯(lián)發(fā)酵溫度為37 ℃

2.2.3.2 偶聯(lián)發(fā)酵時間對活菌總數(shù)的影響

由于干酪乳桿菌LC102產(chǎn)酸能力較凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951強，且后者的酸耐受能力弱于前者，因此凝結(jié)芽孢桿菌生長到對數(shù)生長期后再開始接入干酪乳桿菌后，共培養(yǎng)時間長短成為決定耦合工藝是否成功的又一關(guān)鍵因素，結(jié)果如圖7所示。隨著發(fā)酵時間的延長，活菌總數(shù)呈先增大后降低的趨勢，偶聯(lián)發(fā)酵8 h達到最大值3.37×109CFU/mL，此時凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)為1.95×109CFU/mL。

圖7 不同發(fā)酵時間對活菌總數(shù)的影響Fig.7 Effects of different fermentation time on the total viable count注：干酪乳桿菌接種量為3%，偶聯(lián)發(fā)酵溫度為37 ℃

2.2.3.3 偶聯(lián)發(fā)酵溫度對活菌總數(shù)的影響

對于偶聯(lián)發(fā)酵而言，偶聯(lián)培養(yǎng)溫度對發(fā)酵十分關(guān)鍵，溫度過高或過低都會影響發(fā)酵菌株生長及代謝情況。研究結(jié)果如圖8所示，當溫度為22～37 ℃時，菌體的生長繁殖隨溫度的上升增加，隨著溫度繼續(xù)增加時，活菌總數(shù)開始降低，當溫度維持在37 ℃時活菌總數(shù)和凝結(jié)芽孢桿菌總數(shù)分別達到3.33×109和1.97×109CFU/mL。

圖8 不同發(fā)酵溫度對活菌總數(shù)的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on the total number of viable count注：干酪乳桿菌接種量為3%，偶聯(lián)發(fā)酵時間為8 h

2.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果與分析

2.2.4.1 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

根據(jù)Bo-Benhnken試驗設(shè)計，在單因素試驗設(shè)計的基礎(chǔ)上，選擇干酪乳桿菌接種量(A)、偶聯(lián)發(fā)酵時間(B)、偶聯(lián)發(fā)酵溫度(C)為自變量，以活菌總數(shù)為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法對發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化。試驗因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Variables and levels of response surface analysis

根據(jù)表1的試驗因素與水平設(shè)計，進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗，具體方案及結(jié)果見表2。

利用Design Expert軟件對表2試驗結(jié)果進行二次多項式擬合，根據(jù)各項的回歸系數(shù)，獲得的二次回歸模型方程為：

X=3.13+0.089A+0.025B+0.091C-0.098AB-0.25AC-0.073BC-0.70A2-0.52B2-0.41C2。

其中：X,活菌總數(shù),109CFU/mL；A,干酪乳桿菌接種量,%；B,發(fā)酵時間,h；C,發(fā)酵溫度,℃。

表2 響應(yīng)面分析試驗結(jié)果Table 2 Results of respose surface analysis

2.2.4.2 響應(yīng)面模型的分析

如表3的方差分析所示，該回歸模型F值為89.11，prob>F值小于0.000 1，從而可以表明該模型達到極顯著的水平，同時，該模型失擬項不顯著p>0.1，決定系數(shù)R2=0.991 3，表明數(shù)據(jù)與模型擬合良好、模型可用?；貧w模型系數(shù)的顯著性分析結(jié)果表明，AC、A2、B2、C2對活菌總數(shù)影響極顯著，A、C、AB對活菌總數(shù)影響顯著，B、BC對活菌總數(shù)影響不顯著。對活菌總數(shù)影響的主次因素依次為偶聯(lián)發(fā)酵溫度>接種量>偶聯(lián)發(fā)酵時間。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

注：**代表差異極顯著p<0.01；*代表差異顯著0.01

2.2.4.3 各因素間的交互作用分析

如圖9～圖11，為各因素間交互作用對發(fā)酵南瓜飲料活菌總數(shù)的影響。由圖可知，各因素之間的交互作用都隨著因素水平的增加，活菌總數(shù)呈先增加后降低的趨勢。接種量(A)和偶聯(lián)發(fā)酵溫度(C)、接種量(A)和偶聯(lián)發(fā)酵時間(B)等高線圖趨于橢圓形，說明其交互作用較強，對活菌總數(shù)的影響較大。而發(fā)酵時間(B)和發(fā)酵溫度(C)之間的交互對活菌總數(shù)影響則相對較小。

圖9 接種量與發(fā)酵時間交互作用響應(yīng)面圖Fig.9 The 3D-surface showing the interaction between inoculum and fermentation time

圖10 接種量與發(fā)酵溫度交互作用響應(yīng)面圖Fig.10 The 3D-surface showing the interaction between inoculum and fermentation temperature

圖11 發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度交互作用響應(yīng)面圖Fig.11 The 3D-surface showing the interaction between fermentation time and fermentation temperature

2.2.4.4 發(fā)酵最佳工藝的優(yōu)化與驗證試驗

利用Design Expert軟件進行分析，得到發(fā)酵南瓜飲料最佳工藝條件是接種量3.05%(V∶V)、發(fā)酵時間8.03 h、發(fā)酵溫度37.48 ℃，在此條件下活菌總數(shù)的預(yù)測值為3.135×109CFU/mL?？紤]到試驗操作的實際情況，將各參數(shù)稍作調(diào)整，即接種量3%(V∶V)、發(fā)酵時間8 h、發(fā)酵溫度37.5 ℃。為了驗證響應(yīng)面分析最佳條件的準確性和可靠性，按上述最佳工藝條件進行3次重復(fù)試驗。結(jié)果顯示，3次重復(fù)試驗的平均值為(2.98±0.65)×109CFU/mL,與3.135×109CFU/mL接近，說明該模型準確可靠。

對優(yōu)化后的發(fā)酵南瓜飲料的理化指標進行測定，結(jié)果見表4。

表4 發(fā)酵南瓜飲料的理化指標Table 4 The physicochemical index of fermentedpumpkin beverage

2.3 發(fā)酵型南瓜飲料功能成分研究

眾所周知，南瓜富含多種營養(yǎng)成分，如氨基酸、多糖、多酚以及活性成分,如β-胡蘿卜素，經(jīng)發(fā)酵后的南瓜飲料的上述物質(zhì)保留情況是決定其品質(zhì)的又一重要因素。經(jīng)測定發(fā)酵型南瓜飲料中粗多糖含量(見表5)與未經(jīng)發(fā)酵的南瓜中粗多糖的含量較為接近,可達到1.5%。β-胡蘿卜素、Vc是重要的抗氧化物質(zhì)，經(jīng)發(fā)酵后兩者均得到較好的保留。

表5 發(fā)酵前后南瓜飲料功能成分含量變化Table 5 Changes of functional composition of unfermentationand fermentation pumpkin drink

南瓜中含有人體所需的多種氨基酸。本文研究發(fā)酵前后南瓜飲料中游離氨基酸、水解氨基酸的變化情況，由表6、表7可知，發(fā)酵南瓜汁中富含18種氨基酸，其中包括人體必需的8種氨基酸和兒童必需的組氨酸，以及谷類食物較易缺乏的賴氨酸。此外，本研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵南瓜飲料還含有具有降血壓、抗驚厥、鎮(zhèn)痛和改善記憶等多種藥理作用的γ-氨基丁酸。

3 結(jié)論

表6 南瓜汁發(fā)酵前后水解氨基酸檢測結(jié)果表 Table 6 The results of hydrolytic amino acids test inunfermentation and fermentation pumpkin drink

表7 南瓜汁發(fā)酵前后游離氨基酸檢測結(jié)果表Table 7 The results of free amino acids test in unfermentationand fermentation pumpkin drink

注：“-”表示不存在此種游離氨基酸。

本研究以南瓜為原料，通過纖維素酶、果膠酶、葡萄糖淀粉酶復(fù)合酶解獲得可發(fā)酵性糖為22.78 g/L的南瓜汁發(fā)酵醪液。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以活菌總數(shù)為響應(yīng)值，采用Box-Benhnken設(shè)計優(yōu)化發(fā)酵南瓜飲料工藝條件。以3%(V∶V)的接種量接種凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC9951，培養(yǎng)16 h后再以相同接種量接種干酪乳桿菌LC102，進行8 h偶聯(lián)發(fā)酵，最終獲得活菌總數(shù)為3.072×109CFU/mL，凝結(jié)芽孢桿菌為1.89×109CFU/mL的發(fā)酵南瓜活菌飲料。通過對其中營養(yǎng)功能成分測定，發(fā)酵南瓜飲料功能成分得到較好保留。氨基酸分析儀分析結(jié)果表明，發(fā)酵南瓜飲料富含18種氨基酸，其中包括人體必需的8種氨基酸以及兒童必需的組氨酸和谷類食物較易缺乏的賴氨酸。本方法研制的發(fā)酵南瓜飲料，采用我國新批準的人用益生凝結(jié)芽孢桿菌和干酪乳桿菌進行混合發(fā)酵，開發(fā)出營養(yǎng)豐富的發(fā)酵飲品，為南瓜利用提供支撐，同時為凝結(jié)芽孢桿菌在食品中的應(yīng)用提供一定參考。