劉娟，陳廣鳳，田紀(jì)春，吳澎*，趙子彤，楊藝，李向陽，唐曉珍

1(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安，271018) 2(德州學(xué)院 生態(tài)與景觀學(xué)院，山東 德州，253023) 3(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，小麥品質(zhì)育種研究室，山東省作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安，271018)

饅頭作為我國北方人民的主食，在膳食結(jié)構(gòu)中一直占有重要的地位。饅頭的質(zhì)構(gòu)性狀也一直被作為評(píng)價(jià)饅頭感官質(zhì)量的好壞重要指標(biāo)，良好的質(zhì)構(gòu)性狀不僅會(huì)提升饅頭的感官質(zhì)量，同時(shí)，也會(huì)增加其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此，改良饅頭的質(zhì)構(gòu)性狀對(duì)饅頭的生產(chǎn)和銷售具有重要的意義。目前，已有許多有關(guān)饅頭質(zhì)構(gòu)性狀的研究[1-7]。但這類研究大多聚焦于小麥粉碎顆粒度、添加膳食纖維或者酵母等影響?zhàn)z頭質(zhì)構(gòu)的外部因素，未能深入探究影響?zhàn)z頭質(zhì)構(gòu)的內(nèi)部因素即原料小麥基因位點(diǎn)的多態(tài)性。

近幾年，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)進(jìn)行目標(biāo)性狀與遺傳基因標(biāo)記或候選基因的關(guān)聯(lián)研究成為熱點(diǎn)。GWAS是通過利用表型性狀和基因自身或臨近基因較小區(qū)域的分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)來實(shí)現(xiàn)基因的精確定位[8-10]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)標(biāo)記作為新型的第三代分子標(biāo)記，與傳統(tǒng)分子標(biāo)記相比SNP具有數(shù)量多、分布廣和密度高的特點(diǎn)，能在待測基因的附近和內(nèi)部提供一系列標(biāo)記[11-12]。目前已應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建[13]、分子標(biāo)記輔助育種[14-16]以及遺傳和物種進(jìn)化分析[17-18]，但基于SNP標(biāo)記的小麥類產(chǎn)品如饅頭、面條等的全基因組關(guān)聯(lián)分析的研究未有報(bào)道。

本研究以205份不同品種的冬小麥為實(shí)驗(yàn)材料，利用分布于小麥全基因組的24 355個(gè)SNP標(biāo)記進(jìn)行性狀與標(biāo)記間的關(guān)聯(lián)分析，以實(shí)現(xiàn)饅頭質(zhì)構(gòu)性狀的精細(xì)基因定位，為從分子角度全面深入研究饅頭的各品質(zhì)性狀奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與表型鑒定

實(shí)驗(yàn)材料為205份來自于中國10個(gè)種植冬小麥的省份及墨西哥與法國的小麥品種，其中203份來自于中國，2份分別來自于墨西哥與法國(表1)。供試材料中有132份品種為骨干親本，73份為高代品系。

在2014和2015年度，分別將205份不同小麥品種種植于山東德州(德州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院)與山東泰安(山東農(nóng)業(yè)大學(xué))，種植條件為：每份材料播種3行，行長2 m，行間距0.25 m，每行播種70粒，重復(fù)兩次。小麥生長期間，進(jìn)行常規(guī)田間管理，沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的病蟲害現(xiàn)象。

表1 供試小麥材料Table 1 Wheat varieties used in this study

小麥成熟后，進(jìn)行收割，并研磨成面粉，將面粉按照最初來源進(jìn)行編號(hào)后參照周素梅等[19]的實(shí)驗(yàn)室饅頭制作方法并略做改進(jìn)。待饅頭冷卻后，平放于桌面上，用切割機(jī)將饅頭沿豎直方向平行切割成3片，取中間片于質(zhì)構(gòu)儀上，在TPA模式下采用P35探頭進(jìn)行壓縮實(shí)驗(yàn)[20]，測試前速度3.00 mm/s，測試和測試后速度1.0 mm/s，壓縮距離50%。第一次壓縮結(jié)束后，探頭回到起始位置，等待3s后進(jìn)行第二次壓縮。并采用SPSS 18.0軟件統(tǒng)計(jì)分析所得數(shù)據(jù)。

1.2 DNA提取和90K SNP芯片分型

根據(jù)稍作改動(dòng)的Triticarte (http://www.triticarte.com.au)方法從不同品種小麥幼葉組織中提取DNA，用0.8%濃度瓊脂糖電泳對(duì)DNA的濃度和質(zhì)量進(jìn)行測定。委托加利弗尼亞大學(xué)生物技術(shù)檢測中心，使用最新開發(fā)的包含81 587個(gè)SNP位點(diǎn)的小麥90K基因芯片對(duì)DNA數(shù)據(jù)進(jìn)行分型，并用GenomeStudio軟件讀取分型結(jié)果并保存。為確保分型數(shù)據(jù)結(jié)果的質(zhì)量，用PLINK v1.07[21]進(jìn)行檢測，選取低基因頻率大于5%和檢出率大于80%的SNP標(biāo)記用于饅頭色澤性狀關(guān)聯(lián)分析[22]，最終得到24 355個(gè)SNP位點(diǎn)。

利用WANG等[23]整合的遺傳位點(diǎn)信息，對(duì)本研究獲得的基因位點(diǎn)進(jìn)行整合，得到實(shí)驗(yàn)群體SNP復(fù)合遺傳圖譜信息(表2)。

表2 SNP復(fù)合遺傳圖譜信息Table 2 Information of SNP in the integrated linkage map

1.3 性狀和標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析

分別運(yùn)用3種模型GLM、GLM_Q、MLM_Q+K對(duì)E3環(huán)境中的饅頭膠著感性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析研究，旨在選出適合關(guān)聯(lián)分析的最優(yōu)統(tǒng)計(jì)模型。在此基礎(chǔ)上利用TASSEL 3.0 軟件對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，當(dāng)標(biāo)記的p<0.001時(shí)表明該標(biāo)記與性狀有顯著關(guān)聯(lián)，p<0.000 1時(shí)說明兩者存在極顯著關(guān)聯(lián)，當(dāng)標(biāo)記在兩個(gè)及以上環(huán)境中同時(shí)被檢測到則認(rèn)為其是目標(biāo)性狀相對(duì)穩(wěn)定的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 饅頭內(nèi)外質(zhì)構(gòu)表型變異分析

4個(gè)環(huán)境中饅頭質(zhì)構(gòu)相關(guān)性狀的表型數(shù)據(jù)如表3所示，7個(gè)色澤相關(guān)性狀均表現(xiàn)出較大的變異系數(shù)。其中，E1環(huán)境黏著性變異系數(shù)最大(58.50%)；彈性變異系數(shù)最小(3.21%)。除此之外，7個(gè)性狀的峰度和偏度的絕對(duì)值大部分都小于1，符合正態(tài)分布，屬于數(shù)量性狀遺傳，適合進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

表3 四個(gè)環(huán)境下饅頭質(zhì)構(gòu)在群體中的表型數(shù)據(jù)Table 3 Phenotypic data of texture traits of steamed bread in four different environment

注：E1：2014年泰安點(diǎn)；E2：2014年德州點(diǎn)；E3：2015年泰安點(diǎn)；E4：2015年德州點(diǎn)。

2.2 關(guān)聯(lián)分析最優(yōu)統(tǒng)計(jì)模型的選擇

運(yùn)用3種模型對(duì)E3環(huán)境中饅頭饅頭膠著性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，得到Manhattan圖和Q-Q plot圖如圖1所示。圖1-a為GLM模型，Manhattan圖表明該模型獲得大量與相關(guān)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，Q-Q plot圖則顯示顯著位點(diǎn)的P值明顯偏離預(yù)期P值，群體存在分層的現(xiàn)象，表明GLM模型對(duì)群體結(jié)構(gòu)校正作用較差，不能很好的控制關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的假陽性。圖1-b為GLM_Q模型，因該模型控制了群體結(jié)構(gòu)Q，使得與GLM模型相比，Manhattan圖檢測到的顯著關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)數(shù)減少，Q-Q plot圖同樣表明顯著位點(diǎn)的P值明顯偏離預(yù)期P值。當(dāng)采用MLM_Q+K模型時(shí)，由于其同時(shí)對(duì)親緣關(guān)系和群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行控制，Manhattan圖獲得的顯著位點(diǎn)明顯減少，說明該模型可較大程度的減少假陽性位點(diǎn)，其Q-Q plot圖顯示的實(shí)際P值與預(yù)期P值吻合，表明可較好地校正群體結(jié)構(gòu)，因此，MLM_Q+K模型的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的，本實(shí)驗(yàn)選擇MLM_Q+K模型對(duì)饅頭質(zhì)構(gòu)進(jìn)行全基因關(guān)聯(lián)分析。

a-GLM模型; b-GLM_Q模型; c-MLM_Q+K模型圖1 E3環(huán)境3種模型饅頭膠著感全基因組關(guān)聯(lián)分析的Manhattan圖和Q-Q plot 圖Fig.1 Manhattan plot and Q-Q plot of GWAS for close feeling using three Modes in two environments注：紅色水平線代表全基因組關(guān)聯(lián)分析的顯著閾值(p<0.001)。

2.3 SNP標(biāo)記與饅頭質(zhì)構(gòu)相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)分析

通過全基因組關(guān)聯(lián)分析，4個(gè)環(huán)境共檢測到313個(gè)與饅頭質(zhì)構(gòu)性狀存在顯著關(guān)聯(lián)(p<0.001)的位點(diǎn)，其中，31個(gè)極顯著(p<0.000 1)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，單個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的遺傳變異貢獻(xiàn)率為8.93%～25.14%，11個(gè)相對(duì)穩(wěn)定關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，46個(gè)高遺傳貢獻(xiàn)率位點(diǎn)(R2>10%)，分布在小麥21條染色體中的15條(表4)。

表4 四個(gè)環(huán)境中與饅頭質(zhì)構(gòu)相關(guān)性狀極顯著 (p<0.000 1)、高貢獻(xiàn)率和穩(wěn)定位點(diǎn)Table 4 Highly significant (p<0.000 1) , or high genetic contribution and stable association MTAs for texturetraits of steamed bread in four environments

續(xù)表4

性狀標(biāo)記染色體位置R2/%p值環(huán)境GENE-2794_5345B11011.362.98E-05E3BS00084907_515B14410.267.00E-05E3BS00067911_517A23211.604.19E-05E4wsnp_JD_c13673_136060667B13610.512.69E-05E4BS00023069_517B17110.423.57E-04E2咀嚼性Excalibur_c4948_907B14514.614.12E-05E2Tdurum_contig61884_8367B14813.38,10.414.35E-05,2.52E-05E1,E2IAAV88367B14413.244.75E-05E2BS00041585_512B709.701.03E-05E1黏聚性BS00065168_511A1710.939.99E-04E2Kukri_c13329_8002D3713.80,12.755.99E-06,5.35E-06E1,E4Tdurum_contig5009_3493A18210.364.87E-04E2RFL_Contig3008_13703B910.745.68E-04E3Tdurum_contig45817_1933B1069.649.72E-05E1BS00067744_515B1018.93,7.832.37E-05,4.79E-04E3,E4RAC875_c27696_7187A13611.851.50E-05E2Tdurum_contig56175_7917A1369.357.07E-05E2硬度BS00041585_512B7010.515.82E-05E1IAAV42062B7010.266.28E-05E1RAC875_c12766_4612B7010.266.28E-05E1IAAV22772B7010.176.79E-05E1BobWhite_c8436_3914A1538.62,7.493.21E-04,6.85E-04E1,E4Tdurum_contig61884_8367B14813.494.59E-05E2Excalibur_c4948_907B14513.031.00E-04E2IAAV88367B14411.971.16E-04E2BS00066342_517B1559.43,7.317.65E-05,8.64E-04E2,E3彈性wsnp_Ex_c10595_172919991A7110.426.13E-05E3Ex_c21450_3961A719.869.46E-05E3Ra_c69908_18771A719.829.72E-05E3Ex_c3201_10461A14010.493.39E-04E2wsnp_Ex_c59373_602608762A8310.024.54E-04E2IAAV15352B14513.665.06E-05E2Tdurum_contig10048_612B14610.074.44E-04E2Tdurum_contig52627_7262B14610.074.44E-04E2BobWhite_c12911_7882B14710.074.44E-04E2wsnp_CAP11_c3226_15880702B14710.074.44E-04E2Excalibur_c4964_2755A3910.134.31E-04E2BS00099401_516A14110.473.44E-04E2GENE-4717_7967D19310.034.56E-04E2回復(fù)性Kukri_c13329_8002D3713.109.39E-06E1RAC875_c5427_4473B9210.583.58E-04E2RAC875_c27696_7187A1369.32,7.637.11-04,5.87E-04E2,E4膠著性Ex_c5445_9815A166.19,5.494.92E-04,9.49E-04E1,E2BS00000020_515D10315.01,11.782.62E-11,4.44E-10E1,E2

注：E1：2014年泰安點(diǎn)；E2:2014年德州點(diǎn)；E3:2015年泰安點(diǎn)；E4:2015年德州點(diǎn)。

檢測到與黏著性極顯著(p<0.000 1)相關(guān)的位點(diǎn)12個(gè)，分布于1B、2A、2B、2D、3A、3B、5B、7A、7B染色體上，單個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的表型變異貢獻(xiàn)率為10.12%～25.14%；位于2A染色體上的位點(diǎn)Kukri_c79633_88、3B染色體上的wsnp_Ex_c40060_47197713和5B染色體上的Tdurum_contig23273_315在兩個(gè)環(huán)境中被同時(shí)檢測到，為相對(duì)穩(wěn)定關(guān)聯(lián)位點(diǎn)；3B染色體上的RFL_Contig5418_347的表型變異貢獻(xiàn)率最大(25.14%)，但只在E3環(huán)境中被檢測到。

檢測到4個(gè)與咀嚼性極顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，分布在2B和7B兩條染色體上，單個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的表型變異貢獻(xiàn)率為9.70%～14.61%；位于7B染色體上極顯著位點(diǎn)Tdurum_contig61884_836在兩個(gè)環(huán)境中表達(dá)，且貢獻(xiàn)率(R2)大于10%，為主效關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。

與黏聚性極顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)為4個(gè)，分布在2B、3D、7A染色體上，單個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的表型變異貢獻(xiàn)率為8.93%～13.80%；2D染色體上的位點(diǎn)Kukri_c13329_800與5B染色體上的BS00067744_51在兩個(gè)環(huán)境中同時(shí)被檢測到，并且極顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)Kukri_c13329_800，貢獻(xiàn)率大于10%，為主效關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。

與硬度極顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)為5個(gè)，分布在1A、2A、2B、5A、6A、7D染色體上，單個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的表型變異貢獻(xiàn)率為10.17%～13.49%；4A染色體上的位點(diǎn)BobWhite_c8436_391與7B染色體上的BS00066342_51在兩個(gè)環(huán)境中表達(dá)，為相對(duì)穩(wěn)定位點(diǎn)。

檢測到4個(gè)與彈性極顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，分布在2B和7B兩條染色體上，單個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的表型變異貢獻(xiàn)率為9.82%～13.66%；3B染色體上的IAAV1535的表型變異貢獻(xiàn)率最大(13.66%)，但只在E2環(huán)境中被檢測到。

檢測到與回復(fù)性和膠著性極顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)較少，分別為1個(gè)，7A染色體上與回復(fù)性相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)RAC875_C27696_718在兩個(gè)環(huán)境中表達(dá)，為相對(duì)穩(wěn)定位點(diǎn)，同為相對(duì)穩(wěn)定位點(diǎn)的還有與膠著性關(guān)聯(lián)的5A染色體上的位點(diǎn)Ex_c5445_981和5D染色體上的位點(diǎn)BS00000020_51，后者的貢獻(xiàn)率大于10%，為主效關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。

2.4 饅頭質(zhì)構(gòu)多效性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)

在與饅頭質(zhì)構(gòu)性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)中(p<0.001)，同時(shí)與2個(gè)及2個(gè)以上性狀存在關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)被稱為多效性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)(表5)。本實(shí)驗(yàn)共檢測到23個(gè)與饅頭質(zhì)構(gòu)性狀存在顯著關(guān)聯(lián)的多效性位點(diǎn)，其中染色體2D上位點(diǎn)Kukri_c13329_800與染色體7A上的位點(diǎn)wsnpcEx_c14654_22713386同時(shí)關(guān)聯(lián)性狀最多(4個(gè))，其次為2B染色體上Tdurum_contig14707_251、4B染色體上Tdurum_contig4974_355和7D染色體上D_contig06359contig118(3個(gè))，1A染色體上BS00056823_51和2A染色體上wsnpcEx_c19556_28530231等18個(gè)位點(diǎn)關(guān)聯(lián)性狀最少(2個(gè))。

3 討論

全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)是將自然群體作為研究的對(duì)象，基于該群體長期的基因重組所導(dǎo)致的連鎖不平衡現(xiàn)象，利用分布于全基因組的SNP來實(shí)現(xiàn)目標(biāo)性狀的多樣性與基因位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析，從而可檢測出與目標(biāo)性狀多樣性有密切關(guān)聯(lián)的基因位點(diǎn)或SNP。目前，GWAS已廣泛應(yīng)用于玉米[24]、水稻[25]等農(nóng)作物的農(nóng)藝性狀相關(guān)位點(diǎn)的挖掘中，由于小麥全基因組的精密圖譜一直在完善之中，因此整合構(gòu)建遺傳圖譜可為GWAS的進(jìn)行提供精細(xì)的SNP遺傳位點(diǎn)信息，具有重要的意義。COLASUONNO等[26]利用硬粒小麥的重組自交系構(gòu)建了包含467個(gè)DArT、5 019個(gè)SNP、182個(gè)SSR標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜，并定位了7個(gè)與色黃素含量有關(guān)的QTL；RAZ等[27]利用90K基因芯片技術(shù)對(duì)硬粒小麥和野生二粒小麥雜交構(gòu)建的140株小麥群體進(jìn)行全基因組掃描，共發(fā)現(xiàn)14 088個(gè)SNPs位點(diǎn)，14個(gè)連鎖群，構(gòu)建了全長為2 110 cm的遺傳圖譜。本研究利用6個(gè)已知群體的SNP標(biāo)記信息，整合了自然群體的24 355個(gè)SNP標(biāo)記的復(fù)合遺傳圖譜，為饅頭質(zhì)構(gòu)相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)提供遺傳信息，具有重要價(jià)值。

本研究利用24 355個(gè)SNP位點(diǎn)以及MLM_Q+K模型對(duì)饅頭質(zhì)構(gòu)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，在顯著水平下檢測到較多的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。一方面說明了檢測位點(diǎn)較為全面，另一方面也表明了該試驗(yàn)群體的遺傳變異較為豐富。此外，環(huán)境因素對(duì)作物基因的表達(dá)有重要的影響，關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的表達(dá)可分為兩類，一類為環(huán)境間特異性表達(dá)，另一類為多種環(huán)境下穩(wěn)定表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了4個(gè)不同環(huán)境E1、E2、E3、E4，并將在兩個(gè)及以上環(huán)境中表達(dá)的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)定義為相對(duì)穩(wěn)定的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。通常，關(guān)聯(lián)分析結(jié)果中顯著性較大的位點(diǎn)與性狀的關(guān)聯(lián)度較高，假陽性的概率低，因此，本實(shí)驗(yàn)將顯著性較大的位點(diǎn)(p<0.000 1)定義為極顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。相對(duì)穩(wěn)定關(guān)聯(lián)位點(diǎn)與極顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)都對(duì)研究饅頭質(zhì)構(gòu)性狀有較大的意義，可有效地發(fā)掘饅頭質(zhì)構(gòu)性狀相關(guān)基因。

4 結(jié)論

利用24 355個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)205種小麥粉饅頭的質(zhì)構(gòu)性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果檢測到31個(gè)與質(zhì)構(gòu)性狀極顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，單個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的遺傳變異貢獻(xiàn)率為8.93%～25.14%，11個(gè)相對(duì)穩(wěn)定關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，5個(gè)主效關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，分布在小麥21條染色體中的15條。其中，主效關(guān)聯(lián)位點(diǎn)Kukri_c13329_800同時(shí)與4個(gè)性狀存在關(guān)聯(lián)。這些標(biāo)記的獲得可用于小麥標(biāo)記輔助育種的選擇，以及為從基因方面對(duì)饅頭各品質(zhì)進(jìn)行全面研究做鋪墊。