蔡 苗，孫新穎，劉慶慧，萬曉媛，黃 倢

（1.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071；2.水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海海洋大學(xué)，上海 201306；3.濟(jì)南大學(xué)前沿交叉科學(xué)研究院，濟(jì)南 250022）

對(duì)蝦養(yǎng)殖作為水產(chǎn)品養(yǎng)殖行業(yè)中的重要的組成部分，其發(fā)展面臨著水質(zhì)、氣候以及濫用藥物等一系列問題的威脅，但最主要的還是病害問題，近年來這一問題也呈現(xiàn)出日益嚴(yán)重的趨勢(shì)［1－3］。白斑綜合征病毒 （white spot syndrome virus，WSSV）是對(duì)蝦養(yǎng)殖行業(yè)中存在的主要病原之一，自從20世紀(jì)90年代首次爆發(fā)以來，引起了全球?qū)ξr養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的廣泛關(guān)注，同時(shí)也對(duì)全世界各地的對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［4］。白斑綜合征病毒是一類無包涵體的具囊膜、一端有尾巴狀結(jié)構(gòu)、桿狀的雙鏈環(huán)狀DNA病毒［2］，大小約為300 kb，感染后在數(shù)天內(nèi)死亡率可達(dá)100%［5］。2005年國(guó)際病毒分類委員會(huì)第7次報(bào)告提出把 WSSV歸入到線形病毒科（Nimaviridae）白斑病毒屬（Whispovirus），它是此新科中唯一的成員［6］。迄今為止，GenBank上共公布了7個(gè)WSSV基因全序列，研究最多的分別有中國(guó)大陸株（WSV-CN，KT995472）、中國(guó)臺(tái)灣株（WSSV-TW，AF440570）和泰國(guó)株（WSSV-TH，AY753327），其中泰國(guó)株具有目前最大的基因組312 kb，被假定成為祖先株［7］。通過基因組全序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)這3個(gè)毒株的基因組序列有約99%的核苷酸保持一致性，存在的主要的差異分別是：1）大片段序列插入／缺失；2）易于發(fā)生基因重組的變異區(qū)；3）開放性閱讀框（open reading frames，ORFs）內(nèi)出現(xiàn)的重復(fù)單元變化差異（variable number tandem repeat，VNTR）；4）轉(zhuǎn)座酶基因序列存在與否；5）單核苷酸的缺失、插入及 多 態(tài) 性 （single-nucleotide polymorphisms，SNPs）［8－9］。目前應(yīng)用于 WSSV流行病學(xué)研究的主要有 ORF14／15和 ORF23／24的缺失變化，ORF75、ORF94和 ORF125的 VNTR及SNPs［10－12］。有研究表明，在可變區(qū) ORF14／15和ORF23／24上出現(xiàn)的大片段缺失情況與地理位置有關(guān)［11］，其中可變區(qū) ORF14／15通過重組逐步形成，而可變區(qū)ORF23／24常出現(xiàn)大片段缺失；在ORF75上有兩種重復(fù)單元（repeat units，RUs），分別為 45 bp和 102 bp，在第 3、15、30、40、42、44和83個(gè)堿基處存在多態(tài)性；ORF94上的RUs大小為54 bp，在48位有多態(tài)性；而ORF125上的RUs有69 bp，第1、2和倒數(shù)第 1個(gè)重復(fù)單元有其特有的SNP，從第3到倒數(shù)第2個(gè)重復(fù)單元在第 8、18、25、66和 69位堿基具有多態(tài)性［9，11］。在之前有關(guān)WSSV流行病學(xué)的研究中大多只涉及到重復(fù)單元的數(shù)量，然而對(duì)于每個(gè)重復(fù)單元都可能存在單核苷酸的缺失、插入及多態(tài)性。因此僅僅考慮重復(fù)單元的數(shù)量而忽略單核苷酸多態(tài)性則可能得不到理想的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)選取2016年1－7月從中國(guó)部分地區(qū)采集到的47份WSSV陽性樣本，通過特定引物對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，繼而進(jìn)行測(cè)序并分析比較不同地區(qū)樣本的ORF14／15和ORF23／24序列缺失情況，ORF75、ORF94和 ORF125的 VNTR及SNPs變化情況，并以此來探討WSSV不同毒株間的遺傳進(jìn)化差異，以期為WSSV分子流行病學(xué)研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

本實(shí)驗(yàn)室于2016年1－7月WSSV病害爆發(fā)期間，在山東、河北和浙江3省采集到47份患病樣本，所有實(shí)驗(yàn)樣本采集后均置于－80℃的冰箱冷凍保存。樣本信息見表1。

1.2 病毒核酸提取

取約30 mg鰓組織，進(jìn)行DNA提取，提取產(chǎn)物置于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR檢測(cè)

按照 GB／T 28630.2－2012白斑綜合征（WSD）診斷規(guī)程第2部分套式PCR檢測(cè)法對(duì)DNA樣本進(jìn)行WSSV檢測(cè)。而后通過1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.4 目的基因擴(kuò)增

將1.3中檢測(cè)呈WSSV陽性的樣本通過特定引物進(jìn)行擴(kuò)增，采用25uL的體系：10×PCR反應(yīng)緩沖液（含 Mg2＋）2.5μL，雙蒸水 17.3μL，dNTP 2μL，正向與反向引物各 0.5μL，Ex Taq DNA聚合酶0.2μL，WSSV模板1μL。PCR擴(kuò)增中使用的引物與反應(yīng)條件見表2。

1.5 目的基因克隆及片段分析

將1.4中的陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化后與載體 pMD18-T連接、轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細(xì)胞，在LB肉湯培養(yǎng)液中37℃振蕩含1 h復(fù)蘇抗性。然后涂在含有氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。每個(gè)平板挑取至少5個(gè)單菌落接種于添加氨芐青霉素的LB肉湯培養(yǎng)液中37℃振蕩4 h，取培養(yǎng)物為模板按1.4方法進(jìn)行鑒定。將PCR鑒定為陽性的菌液全部送到上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行DNA雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAMAN 8軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，ORF14／15和ORF23／24片段分別與泰國(guó)株（TH-96-II）和中國(guó)臺(tái)灣株（TW）比對(duì)［13］，分析序列缺失情況；ORF75、ORF94和ORF125測(cè)序結(jié)果進(jìn)行VNTR以及SNPs分析［12］。

2 結(jié)果與分析

2.1 套式PCR結(jié)果

WSSV病害暴發(fā)區(qū)采集到47份樣本中，共有33份樣本在第1輪擴(kuò)增中呈現(xiàn)WSSV陽性，其余14份樣本均在第2輪擴(kuò)增中呈現(xiàn)陽性。

表1 樣本采集信息及ORF75、ORF94和ORF125重復(fù)單元數(shù)目Tab.1 Samples information and repeat units（RUs）present in ORF75，ORF94 and ORF125

表2 PCR擴(kuò)增引物以及反應(yīng)條件Tab.2 PCR primers and cycling conditions

2.2 目的基因擴(kuò)增結(jié)果

在WSSV樣本擴(kuò)增中有23份樣本（2#、5#、6#、7#、8#、9#、10#、13#、15#、17#、19#、34#、35#、36#、37#、38#、39#、40#、41#、42#、43#、44#、45#）出現(xiàn)ORF14／15的目的條帶，成功擴(kuò)增樣品比率為48.94%，其中13#、15#和19#樣本的目的條帶與其它條帶相比片段明顯大，山東濱州、河北秦皇島和浙江寧波、湖州地區(qū)樣本未有陽性條帶出現(xiàn)（圖1）。而在ORF23／24擴(kuò)增中，有10份樣本（6#、13#、19#、28#、29#、34#、35#、36#、40#、41#）有目的條帶檢出，檢出率為21.28%，條帶大小相差不明顯，山東青島、濱州和浙江寧波、湖州地區(qū)的樣本均未檢出（圖2）。在ORF75擴(kuò)增中，除了山東青島、濱州，河北黃驊、秦皇島和浙江寧波、湖州的樣本外，共有 8份樣本（13#、15#、19#、34#、35#、36#、40#、41#）出現(xiàn)相應(yīng)的陽性條帶，檢出率為17.02%，13#、15#、19#樣本目的條帶較之其它條帶偏大（圖3）。在ORF94擴(kuò)增中，有13份樣本（12#、13#、14#、15#、16#、18#、19#、25#、39#、40#、41#、42#、45#）出現(xiàn)相應(yīng)目的條帶，山東青島、濱州，河北黃驊和浙江湖州樣本未檢出，檢出率為27.66%（圖4）。在ORF125擴(kuò)增中，共有20個(gè)樣本（6#、13#、14#、15#、16#、18#、19#、28#、29#、30#、31#、34#、35#、36#、37#、38#、39#、40#、41#、42#）檢出，檢出率為42.55%，而山東青島、濱州和浙江湖州的樣本未檢出（圖5）。

圖1 ORF14／15的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification result of ORF14／15注：M：DNA Maker DL 2000；（＋）陽性對(duì)照，（-）陰性對(duì)照；1～47：樣本編號(hào)Note：M：DNA Maker DL 2000；（＋）positive control，（-）negative control；1～47：number of samples

圖2 ORF23／24的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification result of ORF23／24注：M：DNA Maker DL 2000；（＋）陽性對(duì)照，（-）陰性對(duì)照；1～47：樣本編號(hào)Note：M：DNA Maker DL 2000；（＋）positive control，（-）negative control；1～47：number of samples

圖3 ORF75的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification result of ORF75注：M：DNA Maker DL 2000；（＋）陽性對(duì)照，（-）陰性對(duì)照；1～47：樣本編號(hào)Note：M：DNA Maker DL 2000；（＋）positive control，（-）negative control；1～47：number of samples

圖4 ORF94的擴(kuò)增Fig.4 Amplification of ORF94注：M：DNA Maker DL 2000；（＋）陽性對(duì)照，（-）陰性對(duì)照；1～47：樣本編號(hào)Note：M：DNA Maker DL 2000；（＋）positive control，（-）negative control；1～47：number of samples

圖5 ORF125擴(kuò)增Fig.5 Amplification of ORF125注：M：DNA Maker DL 2000；（＋）陽性對(duì)照，（-）陰性對(duì)照；1～47：樣本編號(hào)Note：M：DNA Maker DL 2000；（＋）positive control，（-）negative control；1～47：number of samples

2.3 序列比對(duì)

在ORF14／15擴(kuò)增中，共得到4種大小不同的片段，即1 260 bp（山東青島、河北黃驊）、1 270 bp（河北黃驊、唐山、滄州）、1 850 bp（河北唐山）和2 660 bp（山東日照、河北滄州），通過與該片段最為完整的TH-96-II（AY753327）進(jìn)行序列比對(duì)，分別缺失 6 540 bp、6 530 bp、5950 bp和5 140 bp（圖6）。在ORF23／24擴(kuò)增中共得到3種片段，分別是1 137 bp（河北黃驊、山東日照）、1 140 bp（河北滄州、秦皇島）和1 265 bp（河北唐山），同此段區(qū)域最完整的中國(guó)臺(tái)灣株［TW（AF440570）］進(jìn)行序列比對(duì)，缺失長(zhǎng)度分別為12 073 bp、12 070 bp、11 945 bp（圖7）。

圖6 WSSV不同毒株ORF14／15序列比對(duì)Fig.6 Sequence alignment of ORF14／15 in different WSSV strains注：KR：韓國(guó)株（JX515788）；TH：泰國(guó)株（AF369029）；TW：中國(guó)臺(tái)灣株（AF440570）；CN：中國(guó)株（AF332093）.兩側(cè)的矩形表示擴(kuò)增出的序列，括號(hào)內(nèi)數(shù)字表示擴(kuò)增出片段的大小，中間的虛線表示與TH-96-II毒株序列比對(duì)缺失的序列Note：KR：South Korean plant（JX515788）；TH：Thai strain（AF369029）；TW：China Taiwan strain（AF440570）；CN：China plant（AF332093）.Rectangles indicate sequences amplified by ORF14／15，figures in the bracket indicate the length of the amplified fragments，the dotted lines indicate sequences deletions compared with the TH-96-II strain

圖7 WSSV不同毒株ORF23／24區(qū)域的序列比對(duì)Fig.7 Sequence alignment of ORF23／24 in different WSSV strains注：兩側(cè)的矩形表示擴(kuò)增出的序列，括號(hào)內(nèi)數(shù)字表示擴(kuò)增出片段的大小，中間的虛線表示與TW毒株序列比對(duì)缺失的序列Note：Rectangles indicate sequences amplified by ORF23／24，figures in the bracket indicate the length of the amplified fragments，the dotted lines indicate sequences deletions compared with the TW strain

在ORF75擴(kuò)增中，出現(xiàn)了4種大小不一的片段，分別為2 503 bp、2 310 bp、2 341 bp和 1 739 bp，將片段與重復(fù)單元比對(duì)可知，RUs數(shù)目分別為11（山東日照）、8（山東日照）、10（河北滄州）、3（河北唐山）（圖8）。ORF94擴(kuò)增中，共擴(kuò)增出5種片段，分別為 590 bp、698 bp、749 bp、916 bp、1 078 bp，RUs數(shù)目分別為 5（河北秦皇島）、7（河北滄州、唐山）、8（山東日照）、11（浙江寧波、山東日照）、14（山東日照、河北唐山）（表 1）。VNTR和SPNs分析顯示，含有5個(gè)RUs的ORF94片段在48位的堿基為 T、T、T、T、T，含有 7個(gè) RUs的ORF94在48位的堿基為 T、G、G、G、G、T、T，含有8個(gè)RUs的ORF94片段在48位的堿基為T、T、T、T、T、T、T、T，含有 11個(gè) RUs的 ORF94片段在48位的堿基為 T、T、T、T、T、T、G、T、G、T、T，而含有14個(gè)RUs的ORF94在48位的堿基為T、T、T、T、G、G、T、G、G、T、T、T、T、T（表 3）。在 ORF125擴(kuò)增中，共得到3種不同的片段，分別為652 bp、721 bp和790 bp，RUs數(shù)目分別為4（山東日照、河北唐山）、5（河北黃驊、滄州、秦皇島、唐山）、6（山東日照、浙江寧波、河北滄州、唐山）。在ORF125的所有VNTR類型中，不考慮3個(gè)特殊RUs，結(jié)果顯示所有類型在8、18、25、66和69位置的堿基均為 G、G、G、G和 A；而在 9、50、53、61和63位堿基上出現(xiàn)了4種變異（表4）。

圖8 ORF75區(qū)域RUs情況Fig.8 The RUs of ORF75 region注：黑長(zhǎng)方體代表45 bp的重復(fù)單元，紅長(zhǎng)方體代表102 bp的重復(fù)單元Note：The black cubes represent 45 bp RUs and the red cubes represent 102 bp RUs

表3 ORF94區(qū)域各重復(fù)單元在48位的單核苷酸多態(tài)性Tab.3 Single-nucleotide polymorphisms（SNPs）patterns at position 48 of ORF94 region

表4 ORF125區(qū)域各重復(fù)單元在9、50、53、61和63位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性Tab.4 Single-nucleotide polymorphisms（SNPs）patterns at position 9，50，53，61 and 63 of ORF94 region

3 討論

本研究取用2016年1－7月從我國(guó)3省9市包括山東的青島、日照和濱州，河北的黃驊、滄州、秦皇島和唐山，浙江的寧波和湖州的發(fā)病地區(qū)采集到的47份WSSV陽性樣本，以特定的引物擴(kuò)增目的片段，通過測(cè)序分析不同樣本的缺失及變異情況。序列比對(duì)結(jié)果顯示，在開放閱讀框ORF14／15的擴(kuò)增中，分別有6 540 bp、6 530 bp、5 950 bp和5 140 bp的片段缺失，最大程度的缺失為6 540 bp，出現(xiàn)在山東青島、河北黃驊地區(qū)的樣本中，本實(shí)驗(yàn)室孫新穎等［14］在研究中發(fā)現(xiàn)，河北黃驊、曹妃甸、浙江溫州和廣東江門地區(qū)的樣本也出現(xiàn)相同的缺失片段；河北黃驊、唐山、滄州的樣本得到了缺失6 530 bp的片段，本實(shí)驗(yàn)室孫新穎等［15］在2013年和2014年的樣本中均得到相同的缺失情況；本實(shí)驗(yàn)中河北唐山樣本中出現(xiàn)了缺失程度為5 950 bp的片段，這與TANG等［16］對(duì)于馬達(dá)加斯加島、莫桑比亞和查特阿拉伯地區(qū)毒株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，HOA等［17］對(duì)印度和越南南部地區(qū)毒株的調(diào)查中也出現(xiàn)了同樣的結(jié)果。山東日照和河北滄州樣本擴(kuò)增中得到了最大片段，長(zhǎng)度為2 660 bp，缺失片段為5 140 bp，與中國(guó)臺(tái)灣株（TW）僅僅相差兩個(gè)堿基。

在ORF23／24擴(kuò)增中，共得到3種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別為1 137 bp、1 140 bp和1 265 bp，1 137 bp片段與1 140 bp片段相比，保留了9個(gè)堿基的一段GATTTCATC序列，而缺少12個(gè)堿基的一段AGAGGAAGAAGA序列。已報(bào)道中國(guó)臺(tái)灣株（TW）的ORF23／24片段最為完整，因此通常將ORF23／24與TW進(jìn)行比對(duì)。目前，已知泰國(guó)株具有最大的缺失片段為13 120 bp，韓國(guó)株缺失程度居中，為5 654 bp，而中國(guó)株缺失片段最小，僅1 169 bp。本研究中出現(xiàn)的3種缺失情況，分別為 12 073 bp、12 070 bp、11 945 bp，均屬于較大程度的片段缺失，其中12 070 bp的缺失片段也分別出現(xiàn)在2013年和2014年的樣本中［14－15］。在MARKS等［18］和 ZWART等［19］的研究中發(fā)現(xiàn)缺失大片段后保留的短片段在復(fù)制時(shí)往往具有優(yōu)勢(shì)，可能與自身的毒力有關(guān)。

在各地區(qū)樣本的ORF75中，重復(fù)單元數(shù)目差異比較明顯，而相同地區(qū)樣本之間也存在差異，例如同樣是山東日照樣本，RUs數(shù)目存在11和8兩種情況；河北唐山樣本所含的RUs數(shù)目最少，僅為3，這也在同年安徽池州的克氏原螯蝦（Procambarus clarkii前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的最小的ORF75 RUs組合，該組合為102 bp、45 bp和45 bp，與安徽池州的克氏原螯蝦的3RUs一致，其它地區(qū)樣本ORF75 RUs組合均以45 bp、102 bp和45 bp開始，這與大多已報(bào)道的毒株結(jié)果類似［20－23］；從圖 8可以看出，某些 RUs的位置存在保守性，相似片段可能是由于變異得到。

在ORF94擴(kuò)增中，河北秦皇島的樣本得到了最小的片段，為590 bp，有5個(gè) RUs，最大片段1 078 bp中有14個(gè)RUs，這表明相同地區(qū)樣本中的RUs也有差異。HOA等［17］在對(duì)印度和越南的WSSV毒株的研究中發(fā)現(xiàn)病害爆發(fā)區(qū)的WSSV ORF94 RUs數(shù)目大多都小于 8。MARKS等［18］發(fā)現(xiàn)攜帶多種變異毒株的宿主，經(jīng)過繁殖1～2代，大多只能檢測(cè)到基因組小的毒株，因此推測(cè)RU數(shù)目少的WSSV更容易在傳播過程中存活而保留下來［20］，這與之前提到的關(guān)于 ORF23／24缺失大片段后保留的短片段在復(fù)制時(shí)往往具有優(yōu)勢(shì)的結(jié)論一致。

在ORF125擴(kuò)增中，共有3種片段，RUs數(shù)目為 4、5、6，已有的報(bào)道顯示，WSSV ORF125 RUs的第 8、18、25、66和 69位點(diǎn)存在 SNPs［13，22］，而本實(shí)驗(yàn)中所有樣本在8、18、25、66和69位置的堿基均為 G、G、G、G和A，而在9、50、53、61和63位堿基上出現(xiàn)了SNPs。TANG［16］在2013年的研究中發(fā)現(xiàn)，ORF75的重復(fù)單元數(shù)目相同；而大多數(shù)樣本均出現(xiàn)ORF94序列缺失，僅有極個(gè)別樣本出現(xiàn)了數(shù)目不等的RUs；ORF125的RUs數(shù)目也存在差異。MUSTHAQ等［12］和 WAIKHOM等［23］的實(shí)驗(yàn)表明，ORF94在不同宿主中存在一定程度的VNTR。然而 GUDKOVS等［10］研究 中 發(fā)現(xiàn)，ORF94的 RUs沒有任何差異。SINDHUPRIYA等［24］的實(shí)驗(yàn)表明，ORF94的 RUs存在細(xì)微的差異，而ORF75和ORF125不存在VNTR。因此僅僅考慮重復(fù)單元的數(shù)量的差異（VNTR）而忽視單核苷酸多態(tài)性（SNPs）則可能得不到理想的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果。通過增加SNPs的分析則有助于進(jìn)一步區(qū)分具有相同VNTR的毒株。在本實(shí)驗(yàn)中，不同地區(qū)的樣本的ORF94和ORF125均存在VNTR，SNPs的分析結(jié)果則進(jìn)一步顯示出樣本之間的差異性。

本研究結(jié)果表明，2016年的樣本中，WSSV毒株存在一定程度的變異情況，其中ORF14／15和ORF23／24均出現(xiàn)了新的缺失片段，ORF75、ORF94和ORF125的VNTR以及SNPs變化情況也存在明顯差異，但總體較2013年和2014年的樣本表現(xiàn)出部分穩(wěn)定性。因此可以推測(cè)，WSSV毒株的不斷變異是為了更好地適應(yīng)環(huán)境，但變異是否導(dǎo)致WSSV致病性的變化以及變化機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。