劉曉玲，王振東，孫涵甜，王振華，趙振軍，李 忌

（煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264005）

Foxl2（forkhead box l2）是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子基因，研究發(fā)現(xiàn)其在脊椎動(dòng)物卵巢中高表達(dá)，而在精巢中弱表達(dá)或不表達(dá)［1］，深入的功能研究表明，該基因參與哺乳動(dòng)物卵巢功能維持［1－2］。該基因在無脊椎動(dòng)物中的相關(guān)研究相當(dāng)有限，在海膽 （Strongylocentrotus purpuratus）［3］、皮 海 綿（Suberites domuncula）［4］、太 平 洋 牡 蠣（Crassostrea gigas）［5］和 櫛 孔 扇 貝 （Chlamys farreri）［6］中有表達(dá)研究，且其表達(dá)研究主要集中在轉(zhuǎn)錄水平：其中 TU等［3］對紫色球海膽的Foxl2研究僅發(fā)現(xiàn)胚胎期都有表達(dá)，是一種合子基因，未有深入研究。DHEILLY等［5］利用基因芯片技術(shù)通過差異檢測發(fā)現(xiàn)Foxl2在太平洋牡蠣中是雌性相關(guān)基因，在卵巢中特異表達(dá)。劉曉玲等［7］發(fā)現(xiàn)Foxl2在成體櫛孔扇貝中具與已報(bào)道的脊椎動(dòng)物一樣的明顯性別二態(tài)性表達(dá)，推測該基因在性別穩(wěn)定的無脊椎動(dòng)物櫛孔扇貝的卵巢中發(fā)揮一定功能。LI等［8］通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)Foxl2在蝦夷扇貝 （Patinopecten yessoensis）卵巢中高表達(dá)，推測參與卵巢決定和分化。然而上述無脊椎Foxl2的性別相關(guān)表達(dá)研究僅集中在轉(zhuǎn)錄水平，僅ADELL等［4］利用免疫組化技術(shù)對皮海綿的Sd-Foxl2進(jìn)行了蛋白水平表達(dá)檢測，發(fā)現(xiàn)在各種細(xì)胞中都有表達(dá)，認(rèn)為在皮海綿中該基因不是性別相關(guān)基因。

綜上，F(xiàn)oxl2基因在低等動(dòng)物中的功能尚需深入研究。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究繼續(xù)選取性別穩(wěn)定的櫛孔扇貝為研究對象，通過PCR克隆櫛孔扇貝Foxl2基因，構(gòu)建了大腸桿菌表達(dá)載體并誘導(dǎo)獲得重組蛋白，純化后制備了多克隆抗體，探索了Foxl2蛋白在性腺中的表達(dá)，旨在為進(jìn)一步研究Foxl2在櫛孔扇貝卵巢中的作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

櫛孔扇貝cDNA、質(zhì)粒及菌種cDNA均由本實(shí)驗(yàn)室制備，DH5α、BL21（DE3）及載 pET-28a等則購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試劑與儀器

限制性內(nèi)切酶 EcoRΙ和 HindIII、T4 DNA連接酶等工具酶以及IPTG等購自寶生物工程 （大連）有限公司；PCR反應(yīng)體系、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒、Ni-NTA蛋白純化試劑盒、DNA Marker、動(dòng)物組織總蛋白提取試劑盒、羊抗兔IgG購自生工生物工程 （上海）股份有限公司；蛋白Marker購自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；新西蘭大白兔 （New Zealand white rabbits）由煙臺(tái)綠葉制藥公司提供，弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑、考馬斯亮藍(lán)染色液、脫色液等購自德國Sigma公司，PVDF膜購自博士德公司。

儀器包括：搖床DYY－Ⅲ型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀（北京市六一儀器廠）；高速冷凍離心機(jī)5810R型（Eppendorf公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國 UVP公司）；NANODROP 1000核酸蛋白測定儀 （Thermo公司）；TC－XP型基因擴(kuò)增儀 （杭州博日科技有限公司）；RT-6000酶標(biāo)分析儀（Rayto公司）。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)櫛孔扇貝 Foxl2基因cDNA全長（GenBank JN642286）［7］設(shè)計(jì)引物，以期擴(kuò)增獲得其完整的開放閱讀框。對其閱讀框內(nèi)所含的酶切位點(diǎn)及pET-28a載體多克隆位點(diǎn)進(jìn)行分析，在上下游引物中增加EcoRΙ和HindIII兩個(gè)酶切位點(diǎn)序列（下劃線），引物由華大基因公司合成，序列如下：5′GAATTCATGGCCTTGTCATTTTACGA 3′；5′AAGCTTTCACCTCTCTCCCCAGTATG3′。

1.4 目的基因PCR擴(kuò)增、TA克隆及質(zhì)粒提取

采用柱式動(dòng)物RNAout試劑盒（北京天恩澤公司）提取櫛孔扇貝卵巢RNA，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物公司）反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，以此cDNA為模板，構(gòu)建如下20μL PCR體系：10×PCR buffer 2.0μL；MgCl2（25 mM）1.6μL；dNTP（10 mM）0.4μL；引物 （10μM）各2.0μL；Taq DNA聚合酶 （5UμL－1）0.2μL；cDNA模板 1 μL，ddH2O補(bǔ)齊。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，57℃退火35 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸10 min。產(chǎn)物電泳鑒定后TA連接，轉(zhuǎn)化DH5α，篩選陽性克隆后提取質(zhì)粒。

1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與測序鑒定

上述提取的質(zhì)粒與pET-28a分別進(jìn)行EcoRΙ和HindIII雙酶切，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，T4連接酶16℃溫育連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，卡那霉素及菌落PCR篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒雙酶切鑒定，對應(yīng)菌株送華大基因測序。

1.6 重組質(zhì)粒提取及BL21轉(zhuǎn)化

將測序結(jié)果與櫛孔扇貝Foxl2基因序列一致的陽性菌株大量培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21，卡那霉素篩選陽性克隆，并再次測序驗(yàn)證序列。

1.7 蛋白誘導(dǎo)條件優(yōu)化與表達(dá)

分別取陽性克隆30 mL，37℃培養(yǎng)至OD 600 nm達(dá)0.6左右，分別加入IPTG至終濃度為0.2、0.4、0.8、1.0、1.2 mmol·L－1，誘導(dǎo) 6 h對 IPTG誘導(dǎo)濃度進(jìn)行優(yōu)化。

1.8 目標(biāo)蛋白的SDS-PAGE分析及鎳柱純化

取含重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)后菌液4 000 r·min－1離心5 min，收集沉淀，加入無菌1×PBS溶液懸浮，于冰浴中200 W超聲波破碎細(xì)胞。分別取全細(xì)胞、12 000 r·min－1離心后的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析以確定重組蛋白的可溶性。

大量誘導(dǎo)的菌液，用Ni-NTA蛋白純化試劑盒中的Binding／wash buffer（含有終濃度為8 M的尿素）溶解（包涵體），室溫下溫育30～60 min。待溫育完全后，12 000 r·min－1離心30 min，將上清進(jìn)行Ni柱親和層析純化，核酸蛋白測定儀檢測純化蛋白濃度。

1.9 抗體制備與檢測

取200μg純化后的重組Foxl2蛋白，與弗式完全佐劑按1∶1的體積比乳化完全（油包水狀），采用背部皮下多點(diǎn)注射的方法分別免疫兩只雄性新西蘭大白兔；兩周后取100μg純化的Foxl2蛋白與弗式不完全佐劑按1∶1的體積比乳化完全，進(jìn)行二次免疫，兩周后以同樣的方法進(jìn)行第三次免疫，一周后取血，4℃靜置24 h后，血液變?yōu)槟z凍狀，5 000 rpm離心10 min，收集上層血清。

以純化后的Foxl2蛋白為抗原，將制備的抗體血清按照1∶200～1∶256 000倍稀釋，采用HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行間接ELISA分析，當(dāng)OD450nm＝1.0時(shí)，抗血清的稀釋度即為抗體效價(jià)［9］

WB（Western blot）分析所制備抗體的特異性，利用蛋白提取試劑盒（上海生工生物工程公司）提取扇貝成體精卵巢組織蛋白，分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳（兔抗β-actin多抗調(diào)平組織蛋白上樣量），將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用稀釋到1∶2 000的所制抗體血清進(jìn)行孵育，洗膜后再用羊抗兔IgG孵育后顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增得到的Foxl2基因

如圖1所示，利用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增目的基因，獲得與預(yù)期大?。? 119 bp，含引物中增加的酶切位點(diǎn)序列）相符的片段。

圖1 Foxl2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of Foxl2 gene注：1：Foxl2基因擴(kuò)增產(chǎn)物；M：DL2000 DNA markerNotes：1：Foxl2 PCR amplification product；M：DL2000 DNA marker

2.2 重組質(zhì)粒p ET－28a的構(gòu)建與鑒定結(jié)果

目的基因與pET－28a連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，選陽性克隆提取重組質(zhì)粒pET－28a進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2顯示：酶切后出現(xiàn)與目的條帶大小吻合的片段。選取對應(yīng)的陽性菌株送華大基因有限公司完成DNA序列測序，結(jié)果顯示與扇貝Foxl2基因序列完全一致。提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21后再次測序仍與目的基因序列一致。

圖2 重組載體的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant vector by enzyme digestion注：M1：DL2000 DNA marker；1：雙酶切重組質(zhì)粒 pET－28a（箭頭所指為酶切后的目的條帶，另一條為酶切后的pET－28a）；M2：λDNA／HindIII MarkerNotes：M1：DL2000 DNA marker；1：recombinant plasmid pET－28a digested by double restriction enzymes（arrow represents the objective gene fragment，the other band is pET－28a after enzyme digestion）；M2：λDNA／HindIII Marker

2.3 重組蛋白的表達(dá)與鑒定（含條件優(yōu)化）結(jié)果

對IPTG誘導(dǎo)濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖3所示，IPTG終濃度在1.0 mmol L－1以內(nèi)時(shí)，誘導(dǎo)效果隨IPTG濃度增加而增強(qiáng)，故選擇1.0 mmol L－1為最終誘導(dǎo)濃度。

對含空質(zhì)粒及含重組質(zhì)粒的菌液誘導(dǎo)6 h后進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析，結(jié)果如圖4所示，與對應(yīng)含空載體pET－28a的菌液相比，含重組載體的菌液經(jīng)6 h誘導(dǎo)后約在46 KD（采用Dnastar軟件預(yù)測Foxl2蛋白分子量約為41.96 KD，載體上融合表達(dá)的標(biāo)簽約3.7 KD）左右出現(xiàn)較粗的蛋白條帶。

收集細(xì)菌超聲破碎后，離心獲得沉淀和上清，SDS－PAGE電泳結(jié)果顯示：重組蛋白主要存在于沉淀中，說明pET－28a原核表達(dá)的Foxl2蛋白產(chǎn)物主要以包涵體形式存在。

圖3 IPTG濃度對誘導(dǎo)效果的影響Fig.3 Induction effect of different IPTG concentrations注：1：IPTG終濃度為 0 mmol·L－1；2：IPTG終濃度為 0.2 mmol·L－1；3：IPTG濃度為0.4 mmol·L－1；4：IPTG濃度為0.8 mmol·L－1；5：IPTG濃度為 1.0 mmol·L－1；6：IPTG濃度為1.2 mmol·L－1；箭頭所指為目的蛋白Notes：1：IPTG final concentration was 0 mmol·L－1；2：IPTG final concentration was 0.2 mmol· L－1；3： IPTG final concentration was 0.4 mmol·L－1；4：IPTG final concentration was 0.8 mmol·L－1；5：IPTG final concentration was 1.0 mmol·L－1；6：IPTG final concentration was 1.2 mmol·L－1；the arrow shows interest protein

圖4 誘導(dǎo)蛋白SDS－PAGE圖Fig.4 SDS－PAGE of induced protein注：1：空質(zhì)粒菌液全細(xì)胞；2：空質(zhì)粒菌液上清；3：空質(zhì)粒菌液沉淀；4：重組質(zhì)粒菌液全細(xì)胞；5：重組質(zhì)粒菌液上清；6：重組質(zhì)粒菌液沉淀；箭頭所指為目的蛋白Notes：1：whole cell with empty plasmid；2：supernatant with empty plasmid；3：precipitation with empty plasmid；4：whole cell with recombinant plasmid；5：supernatant with recombinant plasmid；6：precipitation with recombinant plasmid；the arrow shows interest protein

2.4 包涵體的溶解與純化結(jié)果

包涵體用含8 M尿素的Binding／wash buffer（Ni－NTA蛋白試劑盒中提供）溶解，利用Ni柱進(jìn)行目的蛋白純化，結(jié)果如圖5所示，獲得目的蛋白，進(jìn)一步測得純化所得蛋白濃度為800μg mL－1。

圖5 蛋白純化SDS－PAGE圖Fig.5 SDS－PAGE of purified protein注：1：純化前蛋白；2：過柱流出液；3：純化后蛋白；箭頭所指為目的蛋白Notes：1：protein before purified；2：column effluent；3：purified protein；the arrow shows interest protein

2.5 多克隆抗體的制備與鑒定

ELISA效價(jià)測定顯示所制備抗體效價(jià)大于1：128 000。WB結(jié)果顯示所制備抗體血清能特異識(shí)別扇貝卵巢中42 KD左右蛋白（與Foxl2大小吻合），F(xiàn)oxl2蛋白在卵巢中表達(dá)，而精巢中幾乎不表達(dá)。

圖6 櫛孔扇貝性腺組織中Foxl2蛋白表達(dá)的Western blot圖Fig.6 Western blot of Foxl2 protein expression in gonads of scallop Chlamys farreri注：1：卵巢；2：精巢Note：1：Ovary；2：Spermary

3 討論

本研究中含F(xiàn)oxl2基因重組pET－28a載體的大腸桿菌在37℃誘導(dǎo)系統(tǒng)中有表達(dá)，但主要以不溶性包涵體形式存在，實(shí)驗(yàn)嘗試用較低溫度條件誘導(dǎo)表達(dá)，其表達(dá)的目的蛋白仍不可溶，或與表達(dá)的Foxl2蛋白偏大有關(guān)，通常大腸桿菌所表達(dá)的胞質(zhì)蛋白大于100個(gè)氨基酸，則容易形成包涵體［10］。本研究中，包涵體經(jīng)尿素溶解后純化所得蛋白免疫新西蘭大白兔，所得抗體效價(jià)高、特異性強(qiáng)，已能滿足后續(xù)研究需要。

在哺乳動(dòng)物中Foxl2基因被認(rèn)為是卵巢分化的早期標(biāo)記分子［11］，對其功能研究發(fā)現(xiàn)，該基因可調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞分化，在卵巢發(fā)育及功能維持方面發(fā)揮作用［12］。而該基因在無脊椎動(dòng)物中的功能研究極少見報(bào)道，LIU等［6，13］通過對櫛孔扇貝中Foxl2 mRNA水平表達(dá)模式研究，推測其在成體卵巢發(fā)育及幼貝卵巢分化中發(fā)揮作用，其具體功能研究有待進(jìn)行。

Foxl2屬于叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族，其功能主要依靠蛋白水平對其他基因的調(diào)控來發(fā)揮［14－15］，對于哺乳動(dòng)物Foxl2基因的研究發(fā)現(xiàn)其蛋白水平與mRNA水平的表達(dá)與定位存在差異，小鼠卵母細(xì)胞中可定位到該基因的mRNA［16］，小鼠和山羊的睪丸中也可檢測到該基因的mRNA［16－17］，但對哺乳動(dòng)物 Foxl2蛋白的表達(dá)研究卻發(fā)現(xiàn)，其僅在卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)，而在精巢和卵母細(xì)胞中不表達(dá)［11］，故有研究者認(rèn)為該蛋白最終是通過調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞增殖的方式發(fā)揮作用［1］。無脊椎動(dòng)物中Foxl2的表達(dá)研究多集中在RNA水平，僅在皮海綿中通過免疫組化研究了Foxl2蛋白的表達(dá)，卻顯示其在各類細(xì)胞中都有所表達(dá)［4］，F(xiàn)oxl2蛋白在無脊椎動(dòng)物中的表達(dá)模式仍不明確。本研究通過制備櫛孔扇貝Foxl2多克隆抗體，進(jìn)一步通過WB檢測到Foxl2在卵巢中強(qiáng)表達(dá)，而在精巢中幾乎不表達(dá)，該結(jié)果與劉曉玲等［7］對櫛孔扇貝成體性腺中RNA的表達(dá)模式相吻合，也與 LI等［8］對蝦夷扇貝中Foxl2轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的研究相符，推測該蛋白在扇貝卵巢中發(fā)揮重要作用。

對櫛孔扇貝Foxl2蛋白進(jìn)行體外表達(dá)及抗體制備可為扇貝卵巢中該蛋白的具體細(xì)胞定位提供分子工具，從而為進(jìn)一步研究其在貝類卵巢中的作用機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4 小結(jié)

本研究首次在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)出櫛孔扇貝的Foxl2蛋白，其在BL21中主要以包涵體形式高效表達(dá)，經(jīng)純化后獲得的Foxl2具強(qiáng)免疫原性，免疫新西蘭大白兔獲得效價(jià)高且能特異識(shí)別天然Foxl2的多克隆抗體，用WB檢測發(fā)現(xiàn)Foxl2蛋白在櫛孔扇貝成體中呈雌性性別相關(guān)表達(dá)，該表達(dá)模式暗示Foxl2蛋白在櫛孔扇貝卵巢中發(fā)揮重要功能。