結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma,CRC)是一種常見的、嚴(yán)重威脅人類生命健康的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。在我國,其發(fā)病率與死亡率呈逐年上升的趨勢[1]。臨床經(jīng)驗告訴我們,早發(fā)現(xiàn)、早治療可讓CRC病人的手術(shù)后5年生存率從50%上升到90%以上[2-3]。因此,如何早發(fā)現(xiàn)CRC成為臨床研究的重點。

以往的研究表明,CRC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸與細(xì)胞凋亡調(diào)控有著密切的關(guān)系,細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動死亡的形式,caspase-3在促進(jìn)細(xì)胞的凋亡中有著重要的作用。許多觸發(fā)細(xì)胞凋亡的因素均是通過激活caspase-3來降解其酶底物,如多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)、DNA裂解因子(DFF)和Lamin B等。研究表明,caspase-3及其底物在CRC中表達(dá)降低,并與癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。老年人群是CRC的高發(fā)人群,因此本研究針對老年CRC病人進(jìn)行caspase-3的表達(dá)檢測,為進(jìn)一步確定該指標(biāo)作為老年CRC早期標(biāo)志物提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 納入2009年6月至2014年6月期間來我院就診的老年CRC病人184例進(jìn)行研究。所有病人年齡60～80歲,平均(76.42±10.73)歲,其中男102例,女82例。均為直腸腺癌,TNM分期Ⅰ期 19例,Ⅱa期21例,Ⅱb期32例,Ⅲa期54例,Ⅲb期42例,Ⅳ期16例。根據(jù)其分化程度,按broder法分為低分化(高度惡性)91例,中分化(高度惡性)54例,高分化(低度惡性)39例;腫瘤發(fā)生部位為上段34例,中段107例,下段43例;浸潤深度T1 19例, T2 34例, T3 75例, T4 56例。本研究采用的血液樣品為病人確診后治療前采集的血液,血液樣品保存在-80 ℃超低溫冰箱中留用。

1.2 入選及排除標(biāo)準(zhǔn) 入選標(biāo)準(zhǔn):(1)病理學(xué)檢查明確為直腸腺癌;(2)年齡60～80歲;(3)未并發(fā)其他嚴(yán)重疾病。排除并發(fā)其他嚴(yán)重疾病者。

1.3 試劑與儀器

1.3.1 試劑:外周血RNA提取試劑盒(購自美國Invigrogen公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自美國Promega公司);PCR預(yù)混料(購自大連TaKaRa生物公司);組織蛋白提取試劑盒(購自上海生工公司);鼠抗人caspase-3抗體、羊抗鼠HRP抗體(購自美國abcam公司);其他試劑均為分析純試劑。

1.3.2 主要儀器:臺式離心機(jī)、酶標(biāo)儀(購自德國Thermo公司);Veriti FAST PCR儀(購自美國ABI公司);DYY-6C型高壓電泳儀,凝膠成像儀(北京六一儀器廠)。

1.4 方法

1.4.1 免疫組化檢測caspase-3的表達(dá)水平:將病人直腸癌組織(手術(shù)及結(jié)腸鏡下取得的標(biāo)本)立即送檢驗科,即刻進(jìn)行蠟塊包埋,然后進(jìn)行切片,封閉,加入含有終濃度為0.05% Triton X-100的PBS中進(jìn)行通透,加入用PBS以1∶1000稀釋鼠抗人caspase-3一抗,滴加在載玻片切片的位置上,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育3 h。用PBS溶液輕輕沖洗3次,每次5 min。用PBS以1∶3000的比例稀釋生物素標(biāo)記的羊抗鼠二抗,滴加在載玻片蠟塊的位置上,室溫或37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h。用PBS溶液沖洗載玻片,輕輕沖洗5次,每次5 min。滴加SP(鏈霉親和素-過氧化物酶),37 ℃孵育1 h。用PBS溶液沖洗載玻片,輕輕沖洗5次,每次5 min。使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色,使用中性樹膠封片。結(jié)果判定:以胎盤細(xì)胞胞漿或細(xì)胞周圍棕黃色為陽性染色,每張切片選擇5個高倍視野,計數(shù)不少于500個細(xì)胞,取均數(shù)并評分:不著色為0分,著色淡(淺黃色)為1分,著色深(黃褐色)為2分;著色細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞百分率: ≤5%為0分,6%～25%為 1分,26%～50%為2分,>51%為3分,染色程度與染色細(xì)胞百分率得分乘積為最后得分。0～1 分為陰性病例,2分以上為陽性病例。取材剩余組織低溫保存在標(biāo)準(zhǔn)固定液中。

1.4.2 RT-PCR檢測外周血caspase-3表達(dá)水平:使用外周血RNA試劑盒提取所有研究對象外周血總RNA,然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后吸取5μL 含cDNA的樣品,加入10μL PCR預(yù)混料、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、4μL ddH2O,混勻后放入PCR擴(kuò)增儀,以94 ℃ 5 min,然后94 ℃ 30 s,50 ℃ 45 s,72 ℃ 30 s,循環(huán)反應(yīng)30個循環(huán),72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物取出后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。在凝膠成像儀下觀察并拍照記錄,有條帶形成為陽性,無條帶形成為陰性。Caspase-3上游引物序列:5′-AGAGCTGCACTGCGGTATTGAG-3′,下游引物序列:5′-GAACCATGACCCGTCCCTTG-3′;GAPDH內(nèi)參上游引物序列:5′-ATCTTCCAGGAGCGAGAT-3′,下游引物序列:5′-TAAGCAGTTGGTGGTGCA-3′。DAB顯色,采用圖像分析測定儀量化caspase-3灰度積分比值,作為caspase-3蛋白相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計,計數(shù)資料以率表示,2組比較采用χ2檢驗,等級資料比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測caspase-3的表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果顯示,TNM分期與caspase-3的表達(dá)呈反比,分期越高，caspase-3的陽性率越低,分化程度與caspase-3的表達(dá)呈正比,分化程度越高,caspase-3的陽性率越高。不同性別caspase-3的表達(dá)陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。60～70歲病人caspase-3的表達(dá)陽性率比71～80歲病人,但是2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。不同浸潤深度與caspase-3的表達(dá)陽性率呈反比,隨著浸潤深度的增加，caspase-3的陽性率下降,不同腫瘤部位caspase-3的陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 RT-PCR檢測外周血caspase-3的表達(dá)情況 RT-PCR與免疫組化結(jié)果相似,TNM分期與caspase-3的表達(dá)呈反比,分期越高，caspase-3的陽性率越低,分化程度與caspase-3的表達(dá)呈正比,分化程度越高,caspase-3的陽性率越高。不同性別caspase-3的表達(dá)陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。60～70歲病人caspase-3的表達(dá)陽性率高于71～80歲組病人,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。不同浸潤深度與caspase-3的表達(dá)陽性率呈反比,隨著浸潤深度增加,caspase-3的表達(dá)陽性率下降,不同部位caspase-3的陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 病人不同臨床情況組織中caspase-3的表達(dá)比較

3 討論

老年CRC是我國常見的惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅著人類健康。近年來其準(zhǔn)確的診斷和有效的治療已成為醫(yī)生以及科研工作者關(guān)注的熱點問題之一[5]?；谙嚓P(guān)位點的早期鑒別診斷方法的建立對于CRC的早期診斷、早期治療以及提高病人的生存率就顯得十分重要。

腫瘤的發(fā)生不僅與細(xì)胞過度增殖有關(guān),而且與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Caspsae-3 是半胱氨酸蛋白酶家族中的一員,為執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶之一,大多細(xì)胞凋亡途徑都通過caspase-3 引發(fā)細(xì)胞凋亡[6-7]。有研究人員用S-P的方法檢測了15例正常直腸黏膜、39例結(jié)直腸腺瘤和62例CRC標(biāo)本的caspase-3的表達(dá),結(jié)果顯示,在正常結(jié)直腸黏膜、腺瘤和腺癌的caspase-3陽性表達(dá)率分別為80%(12/15),56.4%(22/39)、和45.16%(28/62),腺瘤和腺癌與正常結(jié)直腸黏膜比較,caspase-3的表達(dá)有明顯差異[8]。

表2 RT-PCR檢測病人外周血caspase-3的表達(dá)情況

郝建軍等[9]對直腸癌組織中caspase-3的表達(dá)情況進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示caspase3在腫瘤組織中的陽性率為55.3%,與正常組織的表達(dá)率(78.6%)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。潘益峰等[10]對CRC和息肉中Caspase通路上基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)CASPASE基因在腫瘤的發(fā)生過程中相互作用,相互促進(jìn)。王文娟等[11]對caspase-3在CRC中的表達(dá)進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)CRC組、腺瘤組caspase-3陽性表達(dá)率低于正常組,提示caspase-3表達(dá)與腫瘤分期呈反比。但關(guān)于老年這一特殊群體的caspase-3的表達(dá)情況尚未見報道。

本研究中,RT-PCR檢測外周血caspase-3的表達(dá)情況與免疫組化結(jié)果基本一致,隨著病人腫瘤分期的增加、分化程度的升高和浸潤深度的增加,caspase-3的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢,表明caspase-3的表達(dá)受到抑制。老年人群是直腸癌的高發(fā)人群,本研究針對老年病人進(jìn)行caspase-3的表達(dá)檢測,了解其表達(dá)特點,為進(jìn)一步確定caspase-3作為老年CRC早期標(biāo)志物提供了依據(jù)。