張 超,劉雙平,,鄒慧君,周志磊,3,韓 笑,3,4,姬中偉,3,王宗敏,3,毛 健,3,4,*

(1.江南大學(xué),糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122;2.浙江古越龍山紹興酒股份有限公司,浙江紹興 312000;3.國(guó)家黃酒工程技術(shù)研究中心,浙江紹興 312000;4. 江蘇省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院食品生物技術(shù)研究所，如皋江大食品生物技術(shù)研究所有限公司,江蘇南通 226500)

黃酒作為中國(guó)古老的、特有的酒種,其起始可以追溯到五千年以前[1]。因?yàn)辄S酒“低度、營(yíng)養(yǎng)、保健”,因而被廣大消費(fèi)者贊譽(yù)為“液體蛋糕”,在中國(guó)的江浙滬區(qū)域黃酒在酒類(lèi)消費(fèi)當(dāng)中始終排名前列[2]。黃酒由于其特殊的開(kāi)放式以及濃醪發(fā)酵形式,使得參與發(fā)酵的微生物菌群具有多樣性的特點(diǎn),酵母、霉菌和細(xì)菌等均參與其中[3-4]。目前對(duì)于機(jī)械黃酒發(fā)酵過(guò)程中的菌株分離主要集中在細(xì)菌類(lèi),尤其是乳酸菌,而對(duì)于真菌的分離報(bào)道較少[5-7]。

黃酒中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是酒體評(píng)價(jià)的重要標(biāo)志之一。眾所周知,隨著黃酒酒齡的增長(zhǎng),揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化而使得黃酒的風(fēng)味變得愈加醇厚[8-9]。目前認(rèn)為黃酒中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主要來(lái)源是原料帶入和微生物發(fā)酵產(chǎn)生。在黃酒發(fā)酵過(guò)程中,微生物代謝將發(fā)酵醪液中的糖、有機(jī)酸、氨基酸、風(fēng)味前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為醇類(lèi)、酸類(lèi)、酯類(lèi)、醛酮類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)多種多樣,對(duì)于黃酒的整體風(fēng)味極具影響,因此微生物的發(fā)酵作用是造成黃酒風(fēng)味成分復(fù)雜的重要原因之一[10-12]。

本研究取古越龍山的機(jī)械黃酒發(fā)酵第1、2、3、4、5、7、10、15、22 d醪液,利用傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)方法,分析黃酒發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌及真菌的組成;并分析菌株在黃酒模擬液中生長(zhǎng)情況,研究其在黃酒模擬液中產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的特性。從而全面的了解在發(fā)酵過(guò)程中微生物的組成,并更加實(shí)際的探討了微生物在黃酒發(fā)酵過(guò)程中利用黃酒生產(chǎn)所用原料所產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),為科學(xué)管理生產(chǎn)、提高黃酒風(fēng)味品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發(fā)酵醪液 紹興古越龍山黃酒廠,發(fā)酵第1、2、3、4、5、7、10、15、22 d,取樣后于4 ℃冰箱暫存;麥曲、糯米、糖化酶、液化酶等 紹興古越龍山酒廠;標(biāo)準(zhǔn)品:乙醛、異丁醛、乙酸乙酯、3-甲基丁醛、異丙醇、丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、異丁醇、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、正丁醇、異戊醇、己酸、己酸乙酯、乳酸乙酯、正己醇、辛酸乙酯、正庚醇、糠醛、苯甲醛、2,4-二甲基苯甲醛、1-辛醇、γ-丁內(nèi)酯、癸酸乙酯、苯甲酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、月桂酸乙酯、正己酸、β-苯乙醇、庚酸、苯酚、乙偶姻、γ-壬內(nèi)酯、4-乙基愈創(chuàng)木酚、正辛酸、肉桂酸乙酯、γ-癸內(nèi)酯、十五酸乙酯、丁香酚、壬酸、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、棕櫚酸乙酯、癸酸、2,4-二叔丁基苯酚 純度>99%，上海安普科學(xué)儀器有限公司。

Thermo Micro CL17型高速離心機(jī) 美國(guó)賽默飛世爾科技公司;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 優(yōu)尼柯(上海)儀器有限公司;CX31RTSF型顯微鏡 日本OLYMPUS公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;恒溫?fù)u床 上海合恒儀器設(shè)備有限公司;低速大容量多管離心機(jī) 無(wú)錫瑞江分析儀器有限公司;Thermo Fisher Trace GC-MS 賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微生物的分離與純化 霉菌分離培養(yǎng)基:PDA 固體培養(yǎng)基。酵母分離培養(yǎng)基:YAP固體培養(yǎng)基:葡萄糖1%,蛋白胨1%,酵母膏1%,氨芐青霉素,1%丙酸鈉,瓊脂2%(注:氨芐青霉素鈉為細(xì)菌抑制劑,用量為100 μg/mL不可高溫加熱)。細(xì)菌分離培養(yǎng)基:LB固體培養(yǎng)基:牛肉膏3‰,蛋白胨1%,氯化鈉5‰,瓊脂2%。MRS固體培養(yǎng)基:牛肉膏1%,蛋白胨1%,酵母膏5‰,葡萄糖2%,吐溫80 0.1‰,醋酸鈉 5‰,磷酸氫二鉀2‰,檸檬酸二銨2‰,硫酸鎂0.58‰,硫酸錳0.28‰,瓊脂2%[13-14]。

以上培養(yǎng)基均自然pH,121 ℃滅菌20 min。黃酒發(fā)酵醪液樣品稀釋到合適的梯度,每梯度3個(gè)重復(fù),涂布上述5種培養(yǎng)基平板,分別進(jìn)行好氧培養(yǎng)與厭氧培養(yǎng)。每天觀察菌落形態(tài)并挑選出形態(tài)不同的微生物進(jìn)行劃線純化培養(yǎng),最后經(jīng)3次劃線純化得到純培養(yǎng)物。比較各純培養(yǎng)物形態(tài),剔除形態(tài)一致的純培養(yǎng)物。

1.2.2 分離微生物菌株鑒定

1.2.2.1 利用CTAB法提取菌株DNA 菌株培養(yǎng)液,每1 mL分裝于2 mL EP管中,加入10 μL溶菌酶(50 mg/mL),37 ℃條件放置30 min;加入125 μL 10%的SDS溶液,立即加入5 μL蛋白酶K(20 mg/mL),混均后 65 ℃水浴2 h(每隔10 min上下顛倒混均樣品);6000×g離心10 min,取上清液。之后加入700 μL CTAB提取緩沖液(2% CTAB,1.4 mol/L NaCl,1 mol/L Tris-HCl,0.5 mol/L EDTA),混均后65 ℃水浴1 h,每隔10 min上下顛倒混均樣品[15]。300×g低速離心5 min,取清液而舍棄上面泡沫層及下面的雜質(zhì)。300×g低速離心5 min,取清液而舍棄上面泡沫層及下面的雜質(zhì)。之后用等體積的氯仿-異戊醇(體積比24∶1)混均后于4 ℃條件下,12000×g離心10 min,重復(fù)操作2～3 次,至基本無(wú)中間雜質(zhì)層;用0.6倍體積的異丙醇沉淀DNA,輕輕混勻后于-20 ℃沉淀1 h后于冷凍離心機(jī)12000×g下4 ℃離心10 min,收集核酸沉淀;加入1 mL 70%的乙醇,于4 ℃條件下,12000×g離心10 min,洗滌沉淀2～3 次,倒扣，去除過(guò)量水分,于37 ℃干燥DNA。加50 μL dd水溶解沉淀,得到的DNA樣品置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 進(jìn)行PCR擴(kuò)增 細(xì)菌:通用引物,上游引物序列為27f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3′,下游引物序列為1492r:5′-TACGGCTACCTTGTT ACGACTT-3′,擴(kuò)增片段大小為1500 bp左右。細(xì)菌PCR反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)[16]。

真菌:通用引物,上游引物序列為NS1:5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′,下游引物序列為NS8:5′-TCCGCAGGTTCACCTACGCGA-3′,擴(kuò)增片段大小為1700 bp左右;真菌PCR反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)[17]。

1.2.2.3 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 PCR產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序?qū)ξ⑸镞M(jìn)行生物性鑒定。測(cè)序所得到序列在NCBI中GeneBank上進(jìn)行BLAST比對(duì),確定與已知序列的同源關(guān)系。采用MEGA6.1系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化分析。

1.2.3 黃酒模擬液及菌株發(fā)酵液制備 實(shí)驗(yàn)采用黃酒原料制作黃酒模擬液。取0.100 kg米粉,加入0.86 g麥曲及2 L清水,添加2 mL液化酶,90 ℃液化2 h;用乳酸調(diào)節(jié)pH至4.0,加入2 mL糖化酶,60 ℃糖化2 h作為黃酒模擬液。

1.2.3.1 酵母及細(xì)菌種子液及發(fā)酵液制備 一級(jí)種子液制備:從甘油保藏管中挑取一環(huán)于50 mL液體培養(yǎng)基上,酵母接種至液體YPD,30 ℃培養(yǎng),好氧細(xì)菌接種至液體LB,37 ℃培養(yǎng);厭氧細(xì)菌接種至液體MRS,37 ℃厭氧培養(yǎng);菌株均培養(yǎng)24 h。上述培養(yǎng)菌株,再按照接種量5%轉(zhuǎn)接一次,作為一級(jí)種子液。

二級(jí)種子制備:取一級(jí)種子液5 mL接種至50 mL黃酒模擬液中,30 ℃靜置培養(yǎng),分別在2、5、8、12、20、30、40、48、60 h搖勻取樣,測(cè)定OD600值。繪制各菌在黃酒模擬液中的生長(zhǎng)曲線,以各菌的生長(zhǎng)穩(wěn)定期初始時(shí)刻時(shí)菌液作為二級(jí)種子液。

發(fā)酵液制備:吸取培養(yǎng)各菌二級(jí)種子液5 mL接種至裝有50 mL黃酒模擬液100 mL離心管中,30 ℃靜置培養(yǎng)120 h。

1.2.3.2 霉菌發(fā)酵液制備 從甘油保藏管中挑取一環(huán)菌株劃線于PDA標(biāo)準(zhǔn)固體培養(yǎng)平板上,30 ℃培養(yǎng),待長(zhǎng)出菌苔后劃線至茄形瓶PDA標(biāo)準(zhǔn)固體培養(yǎng)基內(nèi),30 ℃培養(yǎng)48 h,用無(wú)菌水洗出孢子,得到孢子懸浮液,振蕩混勻后于顯微鏡下進(jìn)行血球板計(jì)數(shù),調(diào)整孢子濃度為107個(gè)/mL,吸取10 mL孢子懸浮液接種至裝有200 mL黃酒模擬液錐形瓶當(dāng)中,同時(shí)錐形瓶當(dāng)中加入10顆玻璃珠,30 ℃ 200 r/min搖床培養(yǎng)120 h,不定期用力振蕩搖勻培養(yǎng)基以防霉菌結(jié)成球狀。每隔12 h取5 mL發(fā)酵液,4 ℃,10000 r/min離心10 min,洗滌沉淀,相同條件下離心,沉淀部分105 ℃烘干至恒重,測(cè)菌絲重量。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),菌絲干重為縱坐標(biāo),繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。同樣方法得到霉菌孢子濃度為107個(gè)/mL,吸取5 mL孢子懸浮液接種至裝有50 mL黃酒模擬液100 mL離心管中,30 ℃靜置培養(yǎng)120 h。

1.2.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定 本次研究采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HS-SPME/GC-MS)測(cè)定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),具體操作參照相關(guān)文獻(xiàn)并稍有改動(dòng)[18]。

1.2.4.1 前處理 取發(fā)酵液6 mL于20 mL頂空瓶中,加入2.5 g氯化鈉及20 μL內(nèi)標(biāo)溶液(2-辛醇,濃度為22 mg/L),插入三相萃取頭,于50 ℃條件下吸附45 min,250 ℃解吸附7 min,用于GC-MS測(cè)定。

1.2.4.2 GC-MS條件 GC色譜柱,TG-WAXMS(30 m×0.25 μm×0.25 mm)。GC進(jìn)樣口溫度,250 ℃。GC程序升溫,40 ℃保持3 min;6 ℃/min升溫至10 ℃。10 ℃/min升溫至230 ℃,保持7 min。GC載氣,高純氦氣(>99.999%),不分流,流速為1.0 mL/min。MS離子化方式,EI。MS發(fā)射電流,50 μA。MS電子能量,70 eV。MS離子源溫度,230 ℃。MS傳輸線溫度,250 ℃。MS掃描范圍,33～400 amu。

1.2.4.3 定性及定量分析方法 定性:通過(guò)與NIST 2.0(Agilent Technologies Inc.)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),對(duì)物質(zhì)定性。

定量:將各種風(fēng)味物質(zhì)標(biāo)品混合并稀釋,配成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,具體標(biāo)品濃度范圍配制參見(jiàn)文獻(xiàn)[19],濃度均大于1 μg/L。相同條件下進(jìn)樣,繪制濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)測(cè)定樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)峰面積與標(biāo)樣得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線峰面積對(duì)樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定量。對(duì)于風(fēng)味物質(zhì)含量未能在標(biāo)曲范圍內(nèi),以及其他未能購(gòu)買(mǎi)標(biāo)準(zhǔn)品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)采用2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行半定量計(jì)算。

其中:C為樣品中被檢測(cè)到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量;Cis為內(nèi)標(biāo)物的含量;A1為樣品中被檢測(cè)到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的峰面積;A2為內(nèi)標(biāo)物的峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物的分離及生物鑒定結(jié)果

2.1.1 細(xì)菌分離結(jié)果 實(shí)驗(yàn)從黃酒發(fā)酵醪液中共分離出33株細(xì)菌,其中有5株最后鑒定為乳酸菌。由表1可知,發(fā)酵醪液中的細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、泛菌屬(Pantoea)、魏斯菌屬(Weissbacteria)、梭菌屬(Clostridium)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)等。張鳳杰等[6]利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對(duì)麥曲、浸米水和黃酒發(fā)酵醪中的細(xì)菌進(jìn)行分離和鑒定,共分離出41株細(xì)菌,主要為乳桿菌屬、片球菌屬、醋酸桿菌屬和芽孢桿菌屬等4個(gè)屬,在發(fā)酵醪液中主要為芽孢桿菌屬。胡志明等[7]在黃酒發(fā)酵醪液中篩出13種細(xì)菌,其中12株是芽孢桿菌屬(Bacillus),1株是乳酸菌屬(Lactobacillus);馮浩等[20]從黃酒發(fā)酵醪液中分離出3株乳酸菌,分別為1株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和2株希氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii);吳春[21]在黃酒醪液中分離出13中原核微生物,均為芽孢桿菌屬(Bacillus)。此次研究共從黃酒發(fā)酵醪液中篩選分離出17株芽孢桿菌屬和5株乳酸菌屬細(xì)菌,由此可以看出,黃酒發(fā)酵醪液中主要為芽孢桿菌屬和乳酸菌屬。此外,本次研究還篩選分離出腸桿菌屬(Enterobacter)等其他菌屬,這可能是由于麥曲等原料的制作方式和環(huán)境的不同,導(dǎo)致黃酒發(fā)酵醪液篩選分離結(jié)果的稍有不同。

此外,由表1可知,菌株L12和L26均為Bacillusaerius,L61和L291是同一種菌(Aeribacilluspallidus),L36、L52、L171及L172均鑒定為Bacillusaryabhattai,乳酸菌M9和M34均鑒定為L(zhǎng)actobacillusfermentum。剔除鑒定相似菌株,采用MEGA6.1對(duì)發(fā)酵醪液中分離培養(yǎng)的細(xì)菌測(cè)序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖1所示。

圖1 細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic relationships of 16S rDNA sequences of bacteria

圖2 真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic relationships of 18S rDNA sequences of fungi

表1 細(xì)菌生物鑒定比對(duì)表Table 1 Sequencing results of the isolated bacterial strains

續(xù)表

2.1.2 真菌分離結(jié)果 由表2可得，實(shí)驗(yàn)從發(fā)酵醪液中分離出16株霉菌以及4株酵母,包括傘狀毛霉菌,傘枝犁頭霉,擴(kuò)展青霉,婁地青霉,釀酒酵母等。發(fā)酵醪液中的霉菌主要是來(lái)自于麥曲中[4],目前對(duì)于從發(fā)酵醪液中分離真菌較為少見(jiàn),常見(jiàn)是從麥曲中篩選分離出真菌,毛青鐘[4]從傳統(tǒng)發(fā)酵方式的發(fā)酵醪液中分離出55株酵母,而本次研究從醪液中篩選分離出4株酵母,由此可以看出傳統(tǒng)發(fā)酵方式相對(duì)機(jī)械黃酒發(fā)酵方式的更復(fù)雜性;陳建堯等[22]從機(jī)械麥曲中分離出13個(gè)霉菌屬,主要為犁頭霉屬(Absidiacorymbifera)、曲霉屬(Aspergillusoryzae)、毛霉屬(RhizomucorPusillus)、青霉屬(Penicilliumaurantiogriseum)、畢赤酵母屬(Pichiaburtonii)等。方華[23]采用傳統(tǒng)的微生物分離方法對(duì)黃酒麥曲中的真菌進(jìn)行了分離培養(yǎng)和鑒定,共分離出16株霉菌,其主要霉菌分別是傘枝犁頭霉、米曲霉、微小毛霉、米根霉和煙曲霉。而本次研究從發(fā)酵醪液中同樣篩選分離出犁頭霉屬(Absidiacorymbifera)毛霉屬(RhizomucorPusillus)、青霉屬(Penicilliumaurantiogriseum),由此可以推測(cè),發(fā)酵醪液中霉菌的主要來(lái)源是原料中麥曲。采用MEGA6.1對(duì)發(fā)酵醪液中分離培養(yǎng)的真菌測(cè)序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖1所示所示。

表2 真菌生物鑒定比對(duì)表Table 2 Sequencing results of the isolated fungal strains

2.2 黃酒模擬液中微生物的生長(zhǎng)特性

2.2.1 黃酒模擬液理化指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)測(cè)黃酒模擬液基本理化指標(biāo)如下表3,由表可知,除酒精度外,黃酒模擬液的基本理化指標(biāo)與黃酒發(fā)酵第1 d類(lèi)似[4]。由于微生物對(duì)酒精度的耐受性不同,故而本次實(shí)驗(yàn)均控制酒精度為0 °。

表3 黃酒模擬液基本理化指標(biāo)表Table 3 Basic physical and chemical indexes of the special culture medium

2.2.2 菌株生長(zhǎng)曲線 細(xì)菌、酵母菌株在黃酒模擬液下的生長(zhǎng)曲線如圖3～圖4,霉菌生長(zhǎng)曲線如圖5所示。通過(guò)對(duì)分離微生物在黃酒模擬液中的生長(zhǎng)情況監(jiān)測(cè),發(fā)現(xiàn)除乳酸菌外的細(xì)菌在24 h內(nèi)生長(zhǎng)均是處于延滯期,在此之后,菌株L211、L311、L31、L18在48 h時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期;在60 h時(shí),菌株L12、L171、L272、L172、L172、L5、L1、L291、L14、L22、L61達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期;72 h時(shí),菌株L36、L341、L101、L72、L2、L35、L201、L3、L71、L26、L15、L212、L8、L14達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期。乳酸菌在黃酒模擬液中生長(zhǎng)適應(yīng)較快,均在48 h時(shí)到達(dá)穩(wěn)定期。分離純化酵母菌在19 h均達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期,霉菌除去菌株CO1和MY4在48 h達(dá)到穩(wěn)定期,其余霉菌菌株在72 h達(dá)到穩(wěn)定期;此外,除菌株CO1和MY4外,霉菌利用黃酒模擬液生長(zhǎng)趨勢(shì)很一致。

圖3 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線圖Fig.3 Growth curves of bacteria

圖4 酵母菌生長(zhǎng)曲線圖Fig.4 The growth curves of yeast

圖5 霉菌生長(zhǎng)曲線圖Fig.5 Growth curves of yeast mould

2.2.3 產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析 本研究利用頂空固相微萃取(HS-SPME)結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)菌株產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味情況,通過(guò)與NIST 2.0(Agilent Technologies Inc.)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),對(duì)物質(zhì)定性,共檢測(cè)出142種風(fēng)味物質(zhì),通過(guò)外標(biāo)定量和內(nèi)標(biāo)法結(jié)合分析,對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。如圖6所示,是篩選菌株產(chǎn)總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量圖;測(cè)定未添加菌株的黃酒模擬液的風(fēng)味,以排除在制作黃酒模擬液中由原料和麥曲帶入的風(fēng)味物質(zhì);由圖6可知細(xì)菌中菌株L311產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量最高,其次是菌株L15;真菌中,霉菌中菌株C01產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)最為突出。此外,比較黃酒模擬液中的風(fēng)味物質(zhì)總含量,細(xì)菌中菌株L52、L341以及霉菌中菌株C112、C121、C22、C14、C141、P181等未有增長(zhǎng),表明這些菌株產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)能力較弱。分離培養(yǎng)酵母中,Y7菌株產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)最高,達(dá)3456.57 μg/L,其他酵母Y3、Y4、Y9產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量分別為2985.93、3014.08、3003.18 μg/L。

圖6 菌株產(chǎn)揮發(fā)性化合物總量Fig.6 Total volatile compounds produced by strains注:CK表示黃酒模擬液,未添任何菌株發(fā)酵培養(yǎng);圖中編號(hào)以L、M、X起始為細(xì)菌,C、MY、P為霉菌;以Y起始為酵母菌。

如表4所示,為菌株所產(chǎn)總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量大于480 μg/L的10株菌株,以及酵母菌株Y7。由結(jié)果可知,除酵母外,醇類(lèi)物質(zhì)中,菌株C01產(chǎn)出最高,總醇類(lèi)物質(zhì)含量達(dá)275.83 μg/L,而在菌株C01所產(chǎn)醇類(lèi)物質(zhì)中,產(chǎn)2,3-丁二醇最為突出,為231.23 μg/L。揮發(fā)性酸類(lèi)物質(zhì)中,菌株L311產(chǎn)揮發(fā)性酸類(lèi)物質(zhì)最多,達(dá)261.66 μg/L,己酸為菌株L311產(chǎn)出最高,為160.58 μg/L。除此之外,菌株L311在總脂類(lèi)和總酮醛類(lèi)化合物產(chǎn)出也最高,分別為28.05和610.92 μg/L。酮醛類(lèi)物質(zhì)當(dāng)中,菌株產(chǎn)乙偶姻明顯要高于其他風(fēng)味物質(zhì)?？偡枷阕孱?lèi)化合物含量中,菌株C122產(chǎn)出最高,達(dá)到33.96 μg/L。酵母菌株在產(chǎn)醇類(lèi)物質(zhì)尤為突出,產(chǎn)總醇類(lèi)物質(zhì)達(dá)1519.0 μg/L;此外,由于未對(duì)乙醇進(jìn)行研究,所以未列出酵母產(chǎn)乙醇能力。

表4 10種菌株產(chǎn)風(fēng)味表(μg/L)Table 4 Table of 10 strains producing flavor(μg/L)

3 結(jié)論與討論

通過(guò)傳統(tǒng)的分離培養(yǎng),從發(fā)酵醪液中共篩選出53株菌株,其中有33株細(xì)菌、16株霉菌以及4株酵母,傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法可以從個(gè)體上探討微生物菌株的生長(zhǎng)特性,從而初步推斷菌株在發(fā)酵體系當(dāng)中所作出的貢獻(xiàn),能有效的對(duì)現(xiàn)在流行的測(cè)序手段進(jìn)行補(bǔ)充。本次篩選分離出的細(xì)菌當(dāng)中,分別有17株和5株隸屬于芽孢桿菌屬和乳酸菌屬,由此可知,黃酒發(fā)酵醪液中可分離培養(yǎng)分離的細(xì)菌主要是芽孢桿菌屬和乳酸菌屬;霉菌中篩選分離出犁頭霉屬(Absidiacorymbifera)毛霉屬(RhizomucorPusillus)、青霉屬(Penicilliumaurantiogriseum)等,結(jié)合前人研究,可以推斷發(fā)酵醪液中霉菌主要的來(lái)源是原料中的麥曲。本次研究發(fā)現(xiàn),菌株L311(Clostridiumtyrobutyricum)在產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)的總含量要明顯高于其他細(xì)菌,霉菌中菌株C01(Penicilliumexpansum)產(chǎn)揮發(fā)性香氣物質(zhì)要高于其他霉菌,而在黃酒模擬中,菌株L311和C01分別在48 h和60 h達(dá)到穩(wěn)定期;酵母菌在利用黃酒模擬液產(chǎn)香氣物質(zhì)明顯要高于其他菌株,這與其他研究及其類(lèi)似[23-24]。

紹興古越龍山機(jī)械化黃酒采用大罐發(fā)酵的形式,但是由于發(fā)酵罐中的微生物的生長(zhǎng)情況多變且復(fù)雜,并且由于微生物之間的相互關(guān)系的影響以及微生物自身不可培養(yǎng)的特性,醪液當(dāng)中的微生物不能夠完全利用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法分離得到。因此,對(duì)于發(fā)酵過(guò)程中的微生物的組成情況還不能僅僅依靠傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法,對(duì)于不能分離的微生物還需借助現(xiàn)今分子測(cè)序手段進(jìn)行分析。分離培養(yǎng)的微生物菌株利用黃酒模擬液產(chǎn)香氣物質(zhì)可初步分析出微生物的產(chǎn)香氣物質(zhì)的能力和種類(lèi),但是對(duì)于菌株在真正的發(fā)酵體系當(dāng)中,篩選菌株所能提供的香氣成分有待進(jìn)一步展開(kāi)分析探討。