蘇攀峰,唐慶九,陳 盛,王玉蘭,趙立彬,許劍鋒,劉艷芳,*

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,上海 201106;2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;3.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306;4.湖南炎帝生物工程有限公司,湖南株洲 412000)

葛仙米是多細胞群體的淡水藻類,與地木耳(N.commune)、發(fā)菜(N.flagelliforme)同屬藍藻門(Cyanophyta)、藍藻綱(Cyanophyceae)、段殖藻目(Hormogonales)、念珠藻科(Nostocaceae)、念珠藻屬(Nostoc),自古以來就被人們所食用[1-3]。據(jù)《本草綱目》記載,葛仙米具有治療夜盲癥和燙傷等功效[2]?，F(xiàn)代研究也表明,葛仙米可提高機體的免疫力、抗腫瘤、抗凝血、抗菌和抗氧化能力[4-8]。但環(huán)境污染造成野生葛仙米的產(chǎn)量銳減,使其不能滿足市場需求。近年來,隨著科技的進步,人工培養(yǎng)葛仙米的技術(shù)趨于完善[4],這為葛仙米在食品和工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了保障。對野生與人工培養(yǎng)的葛仙米營養(yǎng)成分分析發(fā)現(xiàn)，其營養(yǎng)豐富，總蛋白含量高,富含多種氨基酸、VC、VE和B族維生素等[9]，還富含多糖,含量9%～30%[5,8,11-12]。

目前,對葛仙米多糖的研究主要集中在提取分離和功能評價方面,黃澤波等[13]對熱水提取的野生葛仙米和人工培養(yǎng)葛仙米多糖進行了比較,發(fā)現(xiàn)野生葛仙米多糖主要含有葡萄糖、半乳糖、木糖和甘露糖,而人工培養(yǎng)葛仙米多糖的單糖組成主要為鼠李糖、墨角藻糖、木糖、甘露糖和半乳糖及葡萄糖。莫開菊等[8,12,14]對野生葛仙米多糖進行了分離純化,獲得糖含量為79.46%、重均分子量Mw為9.564×106Da的多糖組分,主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖及半乳糖醛酸甲酯組成,研究還發(fā)現(xiàn)該多糖具有低濃度高黏度的良好流變學(xué)特性,能夠作為食品添加劑進行開發(fā)。目前國內(nèi)外對人工培養(yǎng)葛仙米多糖的研究相對較少,有關(guān)人工培養(yǎng)的葛仙米多糖的流變學(xué)特性還未見報道。

因此,本文針對人工培養(yǎng)的葛仙米進行提取、得到多糖組分,并對其理化性質(zhì)和溶液的流變學(xué)特性進行了研究,為未來葛仙米多糖的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛仙米 干品，湖南炎帝生物工程有限公司;單糖標品 Sigma公司;三氟乙酸(TFA) Merck公司。

eppendorf AG 22331型高速離心機 Eppendorf公司;eppendorf移液槍 Eppendorf公司;FA2004N型分析天平、DC-2006型低溫恒溫槽 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;HWS12型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DA5002C型靜音空壓機 上海動態(tài)實業(yè)有限公司;MCR302型旋轉(zhuǎn)流變儀 奧地利安東帕(中國)有限公司;冷凍干燥機 Thermo Savant公司;Waters2695型高效液相色譜儀 美國Waters公司;ICS-2500型高效離子色譜儀 Dionex公司；TSK-GEL系列色譜柱(7.8 mm×300 mm,G6000PWXL. G4000PWXL) TOSOH公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葛仙米多糖的提取分離及含量測定 將葛仙米干品超微粉碎后，取其葛仙米10.0 g,加入蒸餾水、料液比(2 g/L),在100 ℃條件下加熱2 h,離心(9000 r/min,15 min)后加入無水乙醇,使乙醇含量(v/v)達到40%醇沉過夜、醇洗4次后加水溶解。真空冷凍干燥得到蓬松狀的葛仙米多糖(NSKP)。

參照文獻[15-16]報道,采用苯酚-硫酸法測得其多糖含量。

1.2.2 葛仙米多糖的分子量測定 采用高效凝膠尺寸排阻色譜-多角度激光散色儀-示差折光檢測儀聯(lián)用分析法(HPSEC-MALLS-RI)系統(tǒng)對葛仙米多糖的分子量進行測定分析,方法參考文獻[17]。

色譜條件:Waters 2695 HPLC 系統(tǒng)配備UV檢測器、示差折光檢測器(RI)、多角度激光光散射檢測器(MALLS),TSK-GEL系列G6000PWXL和G4000PWXL色譜柱(7.8 mm×300 mm)為分析柱,流動相為0.15 mol/L NaNO3、0.05 mol/L NaH2PO4(pH=7、0.02%的N3Na),柱溫30 ℃,流速0.5 mL/min,使用Astra(version 6.1.1,Wyatt Technology,Santa Barbara,CA)數(shù)據(jù)分析軟件對光散射數(shù)據(jù)進行采集和分析,折光指數(shù)增量dn/dc=0.146 mL/g。

上樣條件:稱取葛仙米多糖2.0 mg,用流動相溶解,離心(10000 r/min,20 min)后過0.22 μm濾膜,上樣分析。

1.2.3 單糖組成測定 采用高效離子陰色譜對葛仙米多糖的單糖組成測定,方法參考文獻[18-19]。

色譜條件:Dionex公司的ICS2500離子色譜儀,CarboPac PA20陰離子交換分析柱,脈沖安培檢測器,流動相為0.480 mol/L NaOH,流速為0.45 mL/min,上樣量25 μL,溫度為30 ℃。

1.2.4 質(zhì)量濃度對NSKP溶液表觀黏度的影響 用蒸餾水分別配制質(zhì)量濃度為10、15、20、30、40 mg/mL的NSKP溶液,用流變儀測定不同質(zhì)量濃度溶液的表觀黏度。實驗條件:溫度20 ℃,以剪切速率為自變量、其變化范圍為0.1～1000 s-1,取適量樣品于平行板上,采用型號為PP50的平行平板(板間距離1 mm)。

1.2.5 溫度對NSKP溶液表觀黏度的影響 用蒸餾水分別配制質(zhì)量濃度為10、15、20 mg/mL的NSKP溶液,用流變儀測定溫度對NSKP溶液表觀黏度的影響。實驗條件:溫度掃描范圍為20～80 ℃,剪切速率30 s-1,取適量樣品于平行板上,采用型號為PP50的平行平板(板間距離1 mm)。

1.2.6 pH對NSKP溶液表觀黏度的影響 調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度為15 mg/mL的NSKP溶液的pH分別為3.0、7.0、11.0(采用HCl和NaOH溶液),用流變儀測定其不同pH條件下的表觀黏度。實驗條件同1.2.4。

1.2.7 抗氧化劑和氧化劑對NSKP溶液表觀黏度的影響 向質(zhì)量濃度為15 mg/mL的NSKP溶液中分別加入VC、H2O2,使其濃度達到0.02、0.1 mol/L,用流變儀測定多糖溶液的表觀粘度。實驗條件同1.2.4。

1.2.8 NSKP溶液的動態(tài)振蕩剪切實驗 用蒸餾水分別配制質(zhì)量濃度為10、15、20 mg/mL的NSKP溶液,用流變儀測定多糖溶液在應(yīng)變力strain=2%、振蕩頻率范圍為0.1～10 Hz內(nèi)的儲能模量(G′)和損耗模量(G″)。

1.2.9 NSKP與透明質(zhì)酸的協(xié)效性 將NSKP與透明質(zhì)酸以1∶1的質(zhì)量比混勻配成5 mg/mL濃度的溶液,以5 mg/mL的NSKP與透明質(zhì)酸的單溶液為對照。用流變儀測定不同溶液的表觀黏度。實驗條件同1.2.4。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin7.0和Excel軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NSKP多糖含量及分子量分析

經(jīng)苯酚硫酸法檢測,NSKP組分多糖含量為96.95%。采用HPSEC-MALLS-RI系統(tǒng)測定NSKP的分子量,結(jié)果顯示,該多糖呈現(xiàn)單一對稱峰,重均分子量(Mw)為1.324×105Da,與已報道的從野生葛仙米中獲得的多糖相比[8],人工培養(yǎng)的葛仙米經(jīng)水提醇沉得到的多糖組分分子量更小。

2.2 單糖組成

應(yīng)用高效離子陰色譜分析葛仙米多糖的單糖組成,如圖1,結(jié)果說明葛仙米多糖主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及葡萄糖醛酸組成,其摩爾比為1∶6.73∶10.84∶5.27∶4.88∶3.92,與野生葛仙米多糖組分相比[8],其單糖組成和摩爾比均有不同,這可能與原料和提取方法不同有關(guān)。

圖1 樣品(a)和標準品(b)的離子色譜圖Fig.1 Chromatograms of Nostoc sphaeroids Kutz polysaccharide(a)and standard(b)

2.3 質(zhì)量濃度對NSKP溶液表觀黏度的影響

由圖2可知,在剪切速率變化范圍為0.1～1000 s-1,NSKP溶液表觀黏度會隨著其質(zhì)量濃度的增加而增大,與莫開菊報道的野生葛仙米多糖結(jié)果相似[8,14];NSKP溶液的表觀黏度會隨著剪切速率的增大而降低,說明NSKP溶液具有剪切變稀的特性、是典型的假塑性非牛頓流體;這可能與多糖分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子構(gòu)象有關(guān)[20]。Singthong等[21]認為多糖分子之間能夠通過鏈-鏈纏結(jié)形成有序結(jié)構(gòu),而剪切力可以破壞這種有序結(jié)構(gòu),導(dǎo)致黏度下降。

圖2 質(zhì)量濃度對NSKP溶液表觀黏度的影響Fig.2 Effects of Nostoc sphaeroids Kütz polysaccharide concentration on the viscosity of NSKP solution

2.4 溫度對NSKP溶液表觀黏度的影響

一般情況下,溫度是影響多糖分子結(jié)構(gòu)和黏度的重要因素[22]。由圖3可以得到,在20～80 ℃范圍內(nèi),不同質(zhì)量濃度的NSKP溶液表觀黏度隨溫度升高而降低;在50～80 ℃內(nèi),對多糖濃度20 mg/mL的黏度有急劇下降趨勢。原因可能是在加熱多糖溶液的過程中,分子運動和擴散的劇烈程度增強,導(dǎo)致分子間作用力減小,降低了溶液黏度。

圖3 溫度對NSKP溶液表觀黏度的影響Fig.3 Effects of temperature on the viscosity of NSKP solution

不同多糖溶液黏度對溫度的敏感度具有差異性:Xu等[23]對不同質(zhì)量濃度的烏飯樹葉CHSS多糖溶液研究發(fā)現(xiàn),在一定溫度范圍內(nèi),隨著多糖濃度的增加,溶液的表觀黏度下降程度越大;郭守軍等[24]研究發(fā)現(xiàn)龍須菜多糖溶液黏度在30～80 ℃內(nèi)隨著溫度升高而增加,作者認為由于龍須菜多糖在室溫下溶解較慢,隨著溫度的升高,多糖的溶解性能增加,從而使多糖黏度逐漸增大。

2.5 pH對NSKP溶液表觀黏度的影響

從圖4得出,不同pH使NSKP溶液的表觀黏度發(fā)生改變。對于15 mg/mL多糖溶液:在剪切速率相同的條件下,溶液為中性時多糖黏度最大;但在酸性和堿性的條件下,黏度均有不同程度的下降;原因可能是pH變化引起多糖分子間作用力的改變,即分子間的排斥力增大而不利于分子聚集。

圖4 pH對NSKP溶液表觀黏度的影響Fig.4 Effect of pH on the viscosity of NSKP solution

莫開菊等[8,14]研究野生葛仙米多糖溶液發(fā)現(xiàn):8 mg/mL的多糖濃度溶液黏度隨pH的增加而增加。與本研究結(jié)果不同,造成本文作者與前人實驗結(jié)果差異性的原因可能是多糖含量與單糖組成不同。這可能與多糖含量及結(jié)構(gòu)上的差異有關(guān)。

2.6 抗氧化劑和氧化劑對NSKP溶液表觀黏度的影響

由圖5可知,NSKP溶液黏度隨著H2O2的增多呈下降趨勢;因為H2O2具有較強的氧化性,能夠?qū)⒍嗵堑牧u基氧化,致使多糖分子鏈斷裂,降低多糖溶液黏度[25];加入VC后,NSKP溶液黏度下降,原因可能是VC能夠降低多糖分子間的相互作用[25]。

圖5 抗氧化劑和氧化劑對NSKP溶液表觀黏度的影響Fig.5 Effect of Antioxidant and oxidant on the viscosity of NSKP solution

2.7 NSKP溶液的動態(tài)振蕩剪切結(jié)果

麥克斯韋模型是一個含有存能模量G′和損耗模量G″的二參數(shù)模型,被廣泛用于描述聚合物溶液的粘彈性[26]。儲能模量G′(彈性模量)反映了多糖溶液抵抗形變的能力,損耗模量G″(黏性模量)描述了多糖溶液的黏性特征[27]。二者相交處的頻率稱為交叉頻率。若G′>G″,多糖溶液主要表現(xiàn)為固體彈性性質(zhì);若G′

圖6結(jié)果顯示,隨著剪切振蕩頻率的增大,不同質(zhì)量濃度多糖溶液的G′和G″逐漸升高;且隨著NSKP溶液質(zhì)量濃度的降低,交叉頻率逐漸增加。表明增加多糖的質(zhì)量濃度,能夠增大NSKP溶液的成膠趨勢和彈性特性,主要是由于濃度增加有利于多糖形成纏繞的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[29]。

圖6 振蕩頻率對不同質(zhì)量濃度NSKP溶液的存能模量(G′)和損耗模量(G″)的影響Fig.6 The change of solution storage modulus(G′) and loss modulus(G″)of NSKP solution of different concentrations with frequency注:A、B、C分別是NSKP溶液的質(zhì)量濃度為10、15、20 mg/mL。

2.8 NSKP與透明質(zhì)酸的協(xié)效性

協(xié)同增效作用是非常復(fù)雜的高聚物大分子之間的相互作用,與高聚物的化學(xué)組成、分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[30]。透明質(zhì)酸具有優(yōu)良的流變學(xué)特性[31],相關(guān)材料已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域[32]。由圖7所示,NSKP與透明質(zhì)酸混合溶液的黏度大于二者單一溶液的黏度,說明NSKP與透明質(zhì)酸有協(xié)效增稠的作用,可能與二者均是酸性黏多糖有關(guān)[8,33]。

圖7 NSKP與透明質(zhì)酸的協(xié)同增效作用Fig.7 Synergistic interaction of NSKP with hyaluronic acid

3 結(jié)論

本研究對人工培養(yǎng)的葛仙米進行提取分離,得到多糖含量為96.95%的高純度多糖,其分子量為1.324×105Da,單糖組成復(fù)雜，主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及葡萄糖醛酸組成。應(yīng)用旋轉(zhuǎn)流變儀考察了質(zhì)量濃度、溫度、pH、VC和H2O2等因素對多糖溶液表觀黏度的影響、探究了其動態(tài)黏彈性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在10～40 mg/mL內(nèi),NSKP溶液黏度隨質(zhì)量濃度的增加而升高;NSKP溶液是典型的假塑性非牛頓流體,具有剪切稀釋的特性,且黏度隨著剪切速率的增大而降低;當pH=7時，黏度達到最大；在20～80 ℃內(nèi),溶液黏度隨著溫度的升高而降低;0.02、0.1 mol/L的VC和H2O2均降低多糖溶液的黏度;可見,NSKP溶液的表觀黏度與質(zhì)量濃度、溫度、pH、VC和H2O2等因素有關(guān)。

在掃描頻率0.1～10 Hz內(nèi),儲能模量(G′)和損耗模量(G″)隨NSKP溶液質(zhì)量濃度的增加而增大;NSKP溶液的儲能模量和損耗模量隨頻率升高而增加。此外,NSKP與透明質(zhì)酸有協(xié)效增稠的作用,可以考慮將其應(yīng)用在化妝品方面。