韓建強，盧志遠(yuǎn)，楊鎖住，趙國洪，張以芳，趙 津*

(1.玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 玉溪 653106；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

【研究意義】芽孢桿菌(Bacillus)，革蘭氏陽性桿菌或球菌，具有調(diào)整腸道微生態(tài)[1]、提升飼料的利用率、增強動物體免疫功能[2-4]、抵抗病原微生物[5-6]、減少疾病的爆發(fā)的作用，無毒、無害，可用作飼用微生物制劑。【前人研究進(jìn)展】傅義剛等的研究表明飼料中加入適量的芽孢桿菌可以顯著提高肉雞體內(nèi)的淀粉酶和總蛋白酶含量，對生長發(fā)育和飼料的利用率都遠(yuǎn)高于沒有飼喂的肉雞[7]。Momgkol[8]等研究顯示在飼料中添加0.2 %～0.5 %的納豆枯草芽孢桿菌能明顯提升肉雞的生產(chǎn)性能?！颈狙芯康那腥朦c】從武定雞腸道中分離出10株芽孢桿菌，通過分離鑒定、耐酸、耐膽鹽、腸道粘附、抑菌試驗，選擇優(yōu)良的芽孢桿菌，選用1日齡武定雛雞進(jìn)行飼喂，測定其體重、免疫器官指數(shù)、腸道中乳酸菌含量、料肉比等指標(biāo)。【擬解決的關(guān)鍵問題】為武定雞微生物飼料添加劑的研究和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

健康的武定雞(體重1600 g左右)—來源于云南武定縣周邊農(nóng)戶自家養(yǎng)殖沒有飼喂添加抗生素飼料的武定雞。動物實驗所用雛雞來源于云嶺廣大雛雞廠。

1.2 主要試劑

TakaRa ExTaq、DL2000TMDNA Maker、DL10000 TMDNA Maker購自大連寶生生物工程(大連)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱)購自Bioteke Corporation公司；蛋白酶K、溶菌酶購自MERCK公司；MRS Broth、MRS medium購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購自杭州天和微生物試劑有限公司，培養(yǎng)基購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.3 芽孢桿菌分離鑒定

1.3.1 芽孢桿菌分離培養(yǎng)及染色鏡檢觀察 將小腸除去糞便，無菌剪開用生理鹽水沖洗，再將洗下來的樣品80 ℃水浴15 min，取1 mL樣品傾注于普通瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中24 h。挑取單個生長良好的大菌落，進(jìn)行純培養(yǎng)及涂片染色鏡檢觀察。

1.3.2 芽孢桿菌生化鑒定 參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[9-10]提供的方法進(jìn)行芽孢桿菌的生理生化鑒定。

1.4 芽孢桿菌飼喂菌株篩選

1.4.1 芽孢桿菌的耐酸能力測定 配置pH值1.5、2.5、3.5、4.5的液體培養(yǎng)基，以pH值為6.5的液體培養(yǎng)基作對照。每6 mL培養(yǎng)基接種300 μl菌液，37 ℃靜止培養(yǎng)，12 h后觀察培養(yǎng)基中菌體生長狀況。

1.4.2 芽孢桿菌的耐膽鹽能力測定 配制膽鹽濃度為0.1 %、0.2 %、0.3 %、0.4 %(W/V)的液體培養(yǎng)基，以不加膽鹽的液體培養(yǎng)基作對照，在每6 mL的培養(yǎng)基中接種300 μl的菌液，于37 ℃培養(yǎng)，接種300 min后取菌液做平板計數(shù)。

1.4.3 芽孢桿菌的腸道粘附能力測定 腸黏液的制備：解剖取小腸，無菌生理鹽水沖洗3次，剪開腸壁，鈍塑料片輕輕刮取腸黏液，無菌PBS混勻，4 ℃、12 000 r/min離心2次，每次15 min。取上清液，用Bradford法測定蛋白含量，用PBS(pH值7.4)調(diào)整蛋白濃度為1 mg/mL后在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

體外黏附實驗：腸黏液(1 mg/mL)100 μl加入96孔培養(yǎng)板，4 ℃固定過夜。用PBS洗滌除去未黏附黏液，加100 μl益生菌懸液(108cfu/mL)，30 ℃孵育2 h。用PBS洗滌除去未黏附的益生菌，加50 μl PBS及20 μl MTT(5 mg/mL)，30 ℃孵育1 h后，加裂解液(20 %SDS-50 %DMSO)振蕩30 min。用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值(λ=570 nm)。重復(fù)3次，以脫脂奶粉作陰性對照組。益生菌黏附率( %)=(A1-A0)/(A2-A0)×100 %，式中：A1、A2、A0分別是試驗組、乳酸菌+原液、空白對照組吸光度值。

1.4.4 芽孢桿菌抑菌實驗 將分離的芽孢桿菌在相應(yīng)的培養(yǎng)基上活化3代，用2 mL滅菌生理鹽水將其從平板上洗下制成菌懸液備用；用涂布棒在普通瓊脂平板上分別涂布大腸桿菌和金黃色葡萄球菌；將牛津杯在酒精燈上灼燒滅菌，待稍涼后(50 ℃左右)放置在剛才涂好菌的培養(yǎng)基上；在牛津杯中分別加入200 μl乳酸菌和芽孢桿菌的菌懸液，4 ℃放置2 h；將培養(yǎng)皿放置在37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h；觀察平板上大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長情況，并測量抑菌環(huán)直徑。

1.5 飼用篩選優(yōu)良菌株雛雞飼喂試驗

1.5.1 優(yōu)良菌株16S rDNA鑒定 根據(jù)GenBank上細(xì)菌的16S rDNA基因，合成2條通用引物，擴(kuò)增16S rDNA基因，目的片段大小為1500 bp，引物序列見表1。引物由華大基因科技股份有限公司合成。

表1 細(xì)菌16S rDNA基因通用擴(kuò)增引物

表2 芽孢桿菌參考菌種

將飼用篩選優(yōu)良的芽孢桿菌16S rDNA基因PCR產(chǎn)物送華大基因公司進(jìn)行測序。

1.5.2 優(yōu)良菌株16S rDNA同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹分析 從GenBank中下載16S rDNA參比序列，選取的參比序列為不同動物品種來源及不同種代表菌株。用于芽孢桿菌屬種鑒定的代表菌株16S rDNA參比序列見表2。

1.5.3 優(yōu)良菌株雛雞飼喂試驗 將實驗中所挑選出的抑菌效果、耐酸能力、產(chǎn)酸能力相對較好的菌株飼喂1日齡雛雞，對照組和試驗組分別飼喂20只雛雞，菌液制成1.0×1010個/mL，每日取5 mL加入95 mL水中飼喂雛雞。從雛雞出生的第2天開始喂養(yǎng)，每隔30 d測量1次體重，計算日增重量，并取雞的法氏囊和脾臟稱重，計算免疫器官比，料肉比，統(tǒng)計死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的生化特性

將分離的菌株進(jìn)行生化試驗(運動性、過氧化氫酶、吲哚試驗、明膠液化、V-P實驗、硝酸鹽還原及厭氧生長試驗)和種的生化試驗(乳糖、木糖、葡萄糖等糖發(fā)酵實驗)如表3～4所示，參考《伯杰氏鑒定手冊》[9-10]，鑒定含3株枯草芽孢桿菌、3株地衣芽孢桿菌、2株短小芽孢桿菌、2株萎縮芽孢桿菌。

表3 BacC1～BacC10芽孢桿菌生化鑒定結(jié)果

注：+為陽性，-為陰性，下同。

Note: positive(+), negative(-), similarly hereinafter.

表4 BacC1～BacC10芽孢桿菌生化鑒定結(jié)果

2.2 飼喂芽孢桿菌篩選試驗結(jié)果

2.2.1 芽孢桿菌耐酸能力測定結(jié)果 將所分離的菌株進(jìn)行耐酸能力測定，BacC1和BacC3的耐酸能力較強。

2.2.2 芽孢桿菌耐膽鹽能力測定結(jié)果 將所分離的菌株接種到含不同濃度的膽鹽液體培養(yǎng)基中，經(jīng)過300 min培養(yǎng)，BacC1在0.4 %的膽鹽濃度下，有相對較高的耐受力。

2.2.3 芽孢桿菌腸道粘附能力測定結(jié)果 將所分離的菌株進(jìn)行腸道粘附能力測定。BacC1腸道粘附能力高于其他菌株。

2.2.4 芽孢桿菌抑菌能力測定結(jié)果 采用牛津杯法在體外進(jìn)行抑菌實驗，結(jié)果顯示：BacC1是其中抑菌效果最好的菌株。

2.3 動物實驗結(jié)果

2.3.1 優(yōu)良菌株(BacC1)16S rDNA鑒定結(jié)果 對BacC1進(jìn)行16S rDNA基因片段PCR擴(kuò)增，目的片段在1500 bp左右，與期望值相符。將測序的芽孢桿菌(BacC1)與Genbank中選用的4株芽孢桿菌，用Blast、Clustal、MEGA等生物軟件分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(如圖1～2)。BacC1與枯草芽孢桿菌親緣性較近。BacC1為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)

2.3.2 實驗動物增重結(jié)果 測定30和60日齡雞的平均體重并記錄，結(jié)果顯示飼喂芽孢桿菌組的雛雞的平均增重量顯著高于(P<0.05)對照組。有3.5 %的優(yōu)勢(表5)。

2.3.3 實驗動物的免疫器官指數(shù) 在60日齡采取動物的法氏囊和脾臟稱重，計算其免疫器官指數(shù)，結(jié)果顯示飼喂芽孢桿菌組的雛雞的法氏囊和脾臟的平均重量、免疫器官指數(shù)均顯著高于(P<0.05)對照組(表6)。

圖1 BacC1芽孢桿菌的進(jìn)化樹Fig.1 The phylogenetic tree of strain BacC1

圖2 BacC1芽孢桿菌的親緣性Fig.2 The affinity of BacC1

2.3.4 實驗動物腸道中乳酸菌數(shù)量 分別取30和60日齡雞的腸道，處理后在MRS培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)計算腸道中乳酸菌含量。結(jié)果顯示飼喂芽孢桿菌組的60日齡雞的腸道中乳酸菌含量顯著高于(P<0.05)對照組。有14 %的優(yōu)勢(表7)。

2.3.5 實驗動物死亡結(jié)果統(tǒng)計 在實驗過程中為保證排除抗生素以及疫苗對實驗的影響，本實驗各組雛雞均未食用任何含有抗生素的飼料，且沒有進(jìn)行疫苗免疫。結(jié)果顯示飼喂芽孢桿菌組的雛雞死亡數(shù)低于對照組(表8)。

2.3.6 實驗動物料肉比 記錄試驗動物每日所飼喂的飼料重量，并計算其料肉比，結(jié)果顯示飼喂芽孢桿菌組的雛雞料肉比顯著(P<0.05)低于對照組(表9)。

2.3.7 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果 分離雞血外周淋巴細(xì)胞，以5 μg/mL ConA作為刺激源培養(yǎng)66 h后用CellTiter96AQueous One Soulution Cell Proliferation Assay檢測，計算出每組的刺激指數(shù)SI，并通過SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，由表10可知混合組的淋巴細(xì)胞指數(shù)顯著高于對照組，差異顯著(P<0.05)，單獨飼喂乳酸菌各組的淋巴細(xì)胞指數(shù)高于對照組(P<0.05)，單獨飼喂芽孢桿菌組的淋巴細(xì)胞指數(shù)高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。

表5 實驗動物日增重量

注：用SPSS19.0的單樣本t檢驗分析可知P<0.05差異顯著，下同。

Note： SSPS19.0 software was used to do one-samplettest, and statistical significance was defined asP<0.05, similarly hereinafter.

表6 免疫器官指數(shù)

表7 腸道中乳酸菌含量

表8 雛雞死亡數(shù)

表9 料肉比

3 討 論

國內(nèi)外關(guān)于雞源芽孢桿菌的分離鑒定相關(guān)研究已經(jīng)很成熟。Gregor[11]等人研究發(fā)現(xiàn)雞腸道中存在有雙岐乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊乳桿菌、干酪乳桿菌、唾液乳桿菌、糞腸球菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、假菌絲酵母菌屬、克勒克酵母菌屬等。本實驗從健康武定雞腸道中分離出芽孢桿菌10株，經(jīng)過鑒定確定包含枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌。分離的枯草芽孢桿菌為中國以及美國官方所公布的可用作飼料添加的菌株。

國內(nèi)外有較為成熟的益生菌篩選方法，本實驗采用常用的耐酸、耐膽鹽、產(chǎn)酸、腸道粘附、抑菌等能力指標(biāo)的測定。篩選適合飼用的優(yōu)秀菌株。李麗紅[12]等在篩選益生菌試驗中除上述指標(biāo)外還進(jìn)行了耐高溫試驗，本實驗培養(yǎng)益生菌的溫度接近雞的正常體溫，因此未進(jìn)行相關(guān)實驗內(nèi)容。

表10 ConA刺激外周淋巴細(xì)胞增值反應(yīng)

本實驗通過日增重量、免疫器官指數(shù)、料肉比、死亡率和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化來評價芽孢桿菌的益生效果。由于飼喂時間短，產(chǎn)蛋率以及產(chǎn)蛋重量無法進(jìn)行測量。

4 結(jié) 論

添加BacC1組的武定雞的體重、免疫器官指數(shù)、腸道中乳酸菌含量均顯著(P<0.05)高于對照組。而料肉比顯著(P<0.05)低于對照組。在飲水中加入芽孢桿菌BacC1可以提高雛雞的免疫能力和生產(chǎn)性能。研究結(jié)果為飼料添加菌株的篩選提供科學(xué)依據(jù)。