余 丹，李 斌，屈 東，鄒成義，汪林書

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院飼料研究所，四川 成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川 成都 610066)

【研究意義】芥子堿是菜籽粕等十字花科類飼料中主要抗?fàn)I養(yǎng)因子之一，也是誘發(fā)畜禽發(fā)生魚腥味綜合征[1]的主要前體物質(zhì)，嚴(yán)重影響畜禽生產(chǎn)及產(chǎn)品品質(zhì)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，芥子堿降解微生物的研究主要集中在真菌上[2-3]，但降解效果不穩(wěn)定、效率不高，也未見這些微生物安全性評價報道。相對于真菌，細(xì)菌的基因簡單，代謝旺盛，繁殖速度快，更有利于商業(yè)化生產(chǎn)，因此篩選安全高效的芥子堿降解菌，應(yīng)用前景更加廣闊，但關(guān)于細(xì)菌對芥子堿降解的報道極少。本項目組著眼于細(xì)菌對芥子堿降解的優(yōu)勢，經(jīng)過長期大量篩選，已成功分離培養(yǎng)出了一些芥子堿降解優(yōu)勢細(xì)菌[4]，這些細(xì)菌來源廣泛、培養(yǎng)條件簡單，對芥子堿的降解能力強(qiáng)，但它們對動物機(jī)體會產(chǎn)生何種影響，目前還未見報道。【本研究切入點】本研究擬考察項目組前期分離培養(yǎng)的一株雞源芥子堿降解菌1(sinapine degrading bacteria 1,SDB1)對肉種雞產(chǎn)蛋性能和免疫功能的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】為該菌株進(jìn)一步應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗腹腔注射用SDB1菌株為本實驗室前期從肉種雞腸道中分離培養(yǎng)獲得的芥子堿降解優(yōu)勢菌。

1.2 動物與試驗設(shè)計

本試驗在四川省畜牧科學(xué)研究院簡陽實驗基地進(jìn)行。將324只50周齡健康肉種雞預(yù)飼1周后，平均分成6個組。組1：一次性腹腔注射1 mL生理鹽水；組2～6分別一次性腹腔注射1 mL濃度為106、107、108、109、1010CFU/mL的SDB1菌液，每個組6個重復(fù)，每個重復(fù)9只雞。試驗雞喂養(yǎng)14 d。試驗雞采用3層階梯式籠養(yǎng)，每籠3只雞。平均每只雞每天飼喂125 g同一基礎(chǔ)飼糧?；A(chǔ)飼糧配方參照NRC(1994)和中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)——雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(2004)結(jié)合生產(chǎn)實際配制，如表1所示。營養(yǎng)水平除代謝能為計算值外，其余均為實測值。

1.3 樣品收集和指標(biāo)測定

試驗結(jié)束后，以重復(fù)為單位，每天記錄試驗雞的產(chǎn)蛋量、蛋重，計算每個重復(fù)的平均產(chǎn)蛋率和蛋重。試驗結(jié)束時，以重復(fù)為單位稱重，每個重復(fù)選一只接近平均體重的試驗雞翅靜脈采血8 mL，分別制備血清和抗凝全血。采用酶聯(lián)免疫法測定血清免疫球蛋白M (Immunoglobulin M，IgM)、免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)、分泌型免疫球蛋白A (Secreted immunoglobulin A，sIgA)、白細(xì)胞介素1(Interleukin 1，IL-1)、白細(xì)胞介素2(Interleukin 2，IL-2)、γ干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)、補(bǔ)體C3(Complement 3，C3)、補(bǔ)體C4(Complement 4，C4)水平，試劑盒購自南京建成賽浩科技有限公司；采用流式細(xì)胞儀測定外周血CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比例。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))

注：1)預(yù)混料為每1 kg飼料提供：鐵80.00 mg，銅8.00 mg，錳100.00 mg，鋅80.00 mg，碘0.90 mg，硒0.3 mg；2)預(yù)混料為每1 kg飼料提供：VA 16000.00 IU，VD 4800.00 IU，VE 60.00 IU，VK3 6.00 mg，VB1 6.00 mg，VB2 16.00 mg，VB12 0.04 mg，葉酸2.80 mg，生物素0.24 mg，煙酸 68.00 mg，D-泛酸21.60 mg。

表2 腹腔注射SDB1對肉種雞產(chǎn)蛋性能的影響

注：同行肩標(biāo)無字母或有相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。 Note: In the same row,values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean very significant difference (P<0.01). The same as below.

1.4 統(tǒng)計分析

原始數(shù)據(jù)用Excel 2010進(jìn)行整理，采用IBM SPSS Statistics 22對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用one-way ANOVA法對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用LSD法對差異顯著的結(jié)果進(jìn)行多重比較，各組間數(shù)據(jù)差異顯著水平為P<0.05。結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDB1對肉種雞產(chǎn)蛋性能的影響

如表2所示，預(yù)飼期各組間產(chǎn)蛋率差異均不顯著，正試期SDB1的劑量對肉種雞產(chǎn)蛋率有顯著影響(P<0.05)，其中組3產(chǎn)蛋率最高，顯著高于組4(P<0.05)，極顯著高于組5(P<0.01)和組6(P<0.01)，而組6產(chǎn)蛋率是最低的。組1的產(chǎn)蛋率與其余各組之間差異不顯著(P>0.05)，但在數(shù)值上低于組2和組3。無論預(yù)飼期還是正試期，各組之間蛋重差異均不顯著(P>0.05)。

2.2 SDB1對肉種雞免疫球蛋白的影響

如表3所示，腹腔注射SDB1對肉種雞血清IgM水平有極顯著(P<0.01)的影響。其中，組3的IgM水平最低，極顯著低于組2、組4和組5 (P<0.01)。SDB1對肉種雞血清IgG和sIgA水平的影響沒有達(dá)到顯著水平((P>0.05)，但組6的IgG水平在數(shù)值上最高，為組2的4.43倍；組5的sIgA水平在數(shù)值上最高，為組3的2.76倍。

2.3 SDB1對肉種雞外周血淋巴細(xì)胞比例的影響

如表4所示，腹腔注射SDB1對肉種雞外周血CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比例沒有顯著影響(P>0.05)。各組CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+水平差異不顯著(P>0.05)，但從數(shù)值上看，組1的CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+均最高。

2.4 SDB1對肉種雞細(xì)胞因子的影響

如表5所示，腹腔注射SDB1對肉種雞血清IFN-γ水平的影響沒有達(dá)到顯著水平(P>0.05)，但組5的IFN-γ在數(shù)值上最高，分別比組1和組3高55.97 %和50.40 %，組4的IFN-γ比組1高52.97 %。腹腔注射SDB1對肉種雞血清IL-1和IL-2水平有顯著影響(P<0.05)，其中組5和組6的IL-1水平顯著高于組2和組3(P<0.05)；而組6的IL-2水平顯著高于除組5外的所有組(P<0.05)，極顯著高于組1(P<0.01)；組5的IL-2水平顯著高于組1、組3和組4(P<0.05)。細(xì)胞因子隨劑量的變化規(guī)律也呈現(xiàn)出與產(chǎn)蛋性能相反的趨勢。

表3 腹腔注射SDB1對肉種雞血清免疫球蛋白的影響

表4 腹腔注射SDB1對肉種雞外周血淋巴細(xì)胞比例的影響

表5 腹腔注射SDB1對肉種雞血清部分細(xì)胞因子的影響

表6 腹腔注射SDB1對肉種雞血清補(bǔ)體C3和C4的影響

2.5 SDB1對肉種雞血清補(bǔ)體C3和C4的影響

如表6所示，腹腔注射SDB1對肉種雞血清補(bǔ)體C3和C4的影響沒有達(dá)到顯著水平顯著影響 (P>0.05)，但組5的C3水平最高，分別比組1和組4高59.92 %和60.01 %。

3 討 論

SDB1是本項目組前期分離培養(yǎng)的一株芥子堿降解優(yōu)勢菌，能在體外有效降解芥子堿，但它對動物機(jī)體有何直接影響，目前還不清楚。本文研究了一次性腹腔注射SDB1對肉種雞產(chǎn)蛋性能和免疫功能的影響，結(jié)果腹腔注射低劑量SDB1(≤107CFU/mL)顯著提高了肉種雞的產(chǎn)蛋率。前人在凝結(jié)芽孢桿菌上的研究也得到類似結(jié)果[5]。本研究中，腹腔注射高劑量SDB1(>108CFU/mL)對肉種雞產(chǎn)蛋性能產(chǎn)生了不良影響，這與Marcq等[6]研究結(jié)果相似。但向峰等[7]指出益生菌(0.2 %的濃度≥2×108CFU/mL的枯草芽孢桿菌和0.02 %的濃度≥1×1010CFU/mL的屎腸球菌)對泰和烏雞的生長性能也沒有顯著影響，這些研究使用的微生物劑量范圍與本研究組4的數(shù)量級一致，結(jié)果也類似，說明微生物對動物生產(chǎn)性能的影響與其劑量密切相關(guān)。

動物生產(chǎn)性能是機(jī)體免疫狀態(tài)的外在體現(xiàn)。機(jī)體對外來物質(zhì)免疫應(yīng)答的表現(xiàn)形式主要是以B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫和以T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。反映體液免疫功能指標(biāo)最主要的是IgM、IgG、IgA等免疫球蛋白。IgM是初次體液免疫反應(yīng)產(chǎn)生最早的免疫球蛋白，具有殺菌、溶菌、溶血、促進(jìn)吞噬及凝集的作用；IgG是介導(dǎo)體液免疫的主要抗體；IgA分為血清型和分泌型，其中分泌型的sIgA是機(jī)體黏膜免疫的一道屏障，具有抗菌、抗病毒、抗毒素的免疫學(xué)活性[8]。本研究中低劑量組(≤107CFU/mL)免疫球蛋白水平普遍較低，而高劑量組(≥108CFU/mL)免疫球蛋白水平較高。這說明腹腔注射大于107CFU/mL的SDB1才能有效刺激肉種雞的體液免疫系統(tǒng)。目前微生物對動物體液免疫系統(tǒng)的影響研究報道較多，普遍的結(jié)果是有益菌能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能而有害菌會降低機(jī)體免疫功能。Salim等[9]的研究指出：與對照組和抗生素組相比，在肉雞飼料中添加0.1 %的羅伊氏乳桿菌或乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母的混合物，可以顯著提高肉雞IgA、IgG、IgM水平，且添加乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母的混合物的效果優(yōu)于單獨添加羅伊氏乳桿菌。任貴強(qiáng)[10]等研究指出給小鼠飼喂不同劑量的兩種乳酸桿菌，結(jié)果低、中劑量組血清IgG水平隨著飼喂時間不斷增加，有超過高劑量組的趨勢。本研究的結(jié)果表明了SDB1能有效刺激肉種雞以IgM為主的體液免疫功能，這與上述有益菌的試驗結(jié)果相似，具體作用效果的差異可能與劑量有關(guān)。

細(xì)胞免疫是指T細(xì)胞受到抗原刺激轉(zhuǎn)化為致敏T細(xì)胞，致敏T細(xì)胞及其所釋放的細(xì)胞因子對再次進(jìn)入的抗原的直接殺傷和協(xié)同殺傷作用[8]。根據(jù)T細(xì)胞表面抗原的差異，可將T細(xì)胞分為CD4+和CD8+兩個亞群，前者具有輔助性T細(xì)胞的功能，主要包括CD2+、CD3+、CD4+、CD8-；后者具有抑制性和殺傷性或細(xì)胞毒性T細(xì)胞的功能，主要包括CD2+、CD3+、CD4-、CD8+。本研究結(jié)果顯示腹腔注射SDB1后，肉種雞外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比例沒有顯著變化，說明SDB1對肉種雞細(xì)胞免疫功能沒有顯著影響。本研究中血液樣本是在攻毒后2周采集的，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因是否是T細(xì)胞表面抗原的初期的免疫應(yīng)答已經(jīng)趨于平穩(wěn)，或者是原本就從未產(chǎn)生過顯著的應(yīng)答有待進(jìn)一步研究。因此，下一步更應(yīng)該從抗原應(yīng)答的角度關(guān)注初始T細(xì)胞、活化T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞等的情況。

細(xì)胞因子是免疫細(xì)胞受刺激后產(chǎn)生的非抗體、非補(bǔ)體類具有急速樣性的蛋白質(zhì)分子，主要包括干擾素(interferon, IFN)、白細(xì)胞介素(interleukin, IL)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF)等四大系列。IL-1能誘導(dǎo)T、B細(xì)胞活化增殖，促進(jìn)T細(xì)胞對抗原的激活。IL-2具有廣譜的免疫增強(qiáng)活性，可誘導(dǎo)T、B細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)細(xì)胞毒性T前體細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，并增強(qiáng)其殺傷效應(yīng)。IFN-γ則對體液免疫和細(xì)胞免疫均具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，能通過下調(diào)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，減少細(xì)菌供鐵量；誘導(dǎo)內(nèi)源性一氧化氮生成，直接抑制細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌或增加單核巨噬細(xì)胞的溶酶體溶解細(xì)菌作用，共同消滅細(xì)菌[8]。本研究結(jié)果表明高劑量腹腔注射SDB1后2周，肉種雞血清IL-1和IL-2水平顯著增加；盡管高劑量組IFN-γ水平與低劑量組之間的差異沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)上的顯著水平，但在數(shù)值上已經(jīng)超過50 %，說明腹腔注射SDB1對IFN-γ也是存在影響的。由于血液樣本為SDB1攻毒后2周采集的，可見，腹腔注射SDB1可持續(xù)有效的刺激肉種雞血液中部分細(xì)胞因子。

補(bǔ)體是一組具有酶活性的蛋白質(zhì)，是體內(nèi)重要的免疫效應(yīng)放大系統(tǒng), 發(fā)揮機(jī)體特異性和非特異性的抗感染作用[8]。補(bǔ)體的激活主要有3種途徑，即經(jīng)典途徑、旁路途徑和MBL 途徑。補(bǔ)體C3是補(bǔ)體系統(tǒng)中含量最高且起關(guān)鍵作用的一種成分，所有補(bǔ)體激活途徑均需C3參與。C4是經(jīng)典途徑和MBL 途徑的一個重要組分，但不參與旁路途徑。本研究結(jié)果中，腹腔注射SDB12周后，盡管各組血清C3和C4水平差異不顯著，但組5比組1和組4均高出60 %左右，因此， SDB1對C3的影響也是不可忽視的。本試驗C4的水平在各組差異很小，幾乎沒有變化，這是免疫急性期已過，C4的釋放量已經(jīng)趨于平穩(wěn)，還是存在其它原因，目前還不清楚，需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

SDB1是本項目組前期分離培養(yǎng)的一株芥子堿降解優(yōu)勢菌。本研究結(jié)果表明，低劑量SDB1(≤107CFU/mL)對肉種雞產(chǎn)蛋性能和免疫功能沒有不良影響；而高劑量SDB1(≥108CFU/mL)會顯著增強(qiáng)肉種雞部分體液免疫和細(xì)胞因子水平，但此免疫增強(qiáng)效應(yīng)是以降低產(chǎn)蛋性能為代價。由于微生物產(chǎn)品的有效性與劑量、給藥方式、作用時間、受試動物個體差異等因素均密切相關(guān)，若要將SDB1應(yīng)用于生產(chǎn)實際，還需要更多的動物試驗進(jìn)行支撐。下一步有必要繼續(xù)研究口服或拌料給予SDB1對肉種雞的影響。