黃小環(huán)，周鐵軍，馮曉靈△

(1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 404120；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，四川瀘州 646000)

乳腺癌是一種常見的危及女性健康的惡性腫瘤，具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)。目前臨床上主要采取手術(shù)切除、術(shù)后放化療、內(nèi)分泌治療等手段，但現(xiàn)有治療措施仍不能很好控制其發(fā)展。惡性腫瘤的快速生長(zhǎng)需要血液供應(yīng)，長(zhǎng)久以來(lái)一直認(rèn)為，腫瘤的血管來(lái)源于血管發(fā)生和血管生成兩方面。直到MANIOTIS等[1]提出血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)，一種不依賴于血管內(nèi)皮細(xì)胞的全新腫瘤血供模式，不同于經(jīng)典血管生成，管壁沒(méi)有內(nèi)皮細(xì)胞附著，腫瘤細(xì)胞排列在管壁外表面，其內(nèi)可見紅細(xì)胞、血漿。VM還存在于胃癌、肝細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤中[2-3]。環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)已經(jīng)證實(shí)為參與VM形成的重要因素之一，本研究擬通過(guò)CD34及過(guò)碘酸雪夫反應(yīng)(PAS)雙重染色證實(shí)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中是否存在VM，進(jìn)一步探討COX-2與乳腺癌VM的關(guān)系，從而探討VM表達(dá)陽(yáng)性的乳腺癌是否更具有轉(zhuǎn)移和侵襲性，預(yù)后是否更差，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 110例患者乳腺癌標(biāo)本為試驗(yàn)組，來(lái)自于西南醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2011-2015年手術(shù)切除乳腺癌的石蠟塊，患者術(shù)前未進(jìn)行放療或化療，石蠟切片由兩位高年資的病理醫(yī)師再次閱片確診為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌?；颊呔鶠榕?，年齡28～79歲，腫瘤直徑2～8 cm；腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移80例，未轉(zhuǎn)移30例；根據(jù)WHO乳腺癌分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分級(jí)，其中Ⅰ級(jí)(高分化)26例，Ⅱ和Ⅲ級(jí)(中、低分化)84例。同時(shí)選取30例乳腺良性病變患者(乳腺增生15例、乳腺纖維腺瘤15例)作為對(duì)照組。

1.2試劑 COX-2單克隆抗體購(gòu)于cst公司、CD34單克隆抗體購(gòu)于santa公司、SP法免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)于bioss公司、PAS染色試劑盒購(gòu)于solarbio公司。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學(xué) 取出蠟塊，4 μm厚度連續(xù)切片,經(jīng)二甲苯兩次脫蠟；梯度乙醇置換，流水沖洗；將切片架置于檸檬酸液中，放入高壓鍋中抗原修復(fù)；每張切片加入3%過(guò)氧化氫，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；滴加一抗、Envision試劑和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素適當(dāng)復(fù)染，脫水透明封片。用已知陽(yáng)性片做陽(yáng)性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3.2CD34和PAS雙重染色 先進(jìn)行CD34免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞著色后，水流沖洗1 min，終止顯色反應(yīng)；將切片置于0.5%的過(guò)碘酸溶液中氧化15 min，蒸餾水沖洗2次，每次3 min，此步驟完成后將切片置于Schiff液中，避光下PAS反應(yīng)15 min；蒸餾水沖洗3次，每次1 min，流水沖洗3 min；蘇木素淺染細(xì)胞核1 min，流水沖洗1 min，分化、返藍(lán)，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片。

1.3.3VM結(jié)果判定 鏡下可見由CD34染色陰性的腫瘤細(xì)胞圍成管道樣結(jié)構(gòu)，部分管腔中可見紅細(xì)胞和血漿；PAS染色陽(yáng)性物質(zhì)圍成一層基膜樣結(jié)構(gòu)，將腫瘤細(xì)胞和紅細(xì)胞分開[4]。對(duì)照組乳腺組織中未見上述現(xiàn)象。

1.3.4COX-2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定 在細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)發(fā)現(xiàn)有棕黃色物質(zhì)沉著者為陽(yáng)性，以細(xì)胞染色強(qiáng)度和細(xì)胞陽(yáng)性百分率兩者得分相加來(lái)進(jìn)行判定。無(wú)染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，黃色為3分；細(xì)胞陽(yáng)性率：≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%為3分。上述兩項(xiàng)相加，0～1分為陰性(-)，2～3分為(+)，4分為(++)，5～6分為(+++)，統(tǒng)計(jì)時(shí)，2～6分均記為陽(yáng)性。

A、B：VM在試驗(yàn)組組織中表達(dá)(箭頭示)；C、D：VM在對(duì)照組組織中無(wú)表達(dá)

圖1 VM在乳腺組織的表達(dá)(CD34、PAS，×400)

2 結(jié) 果

2.1VM在乳腺組織的表達(dá) CD34、PAS雙重染色后可見PAS染色陽(yáng)性物質(zhì)圍成一層基膜樣結(jié)構(gòu)，將腫瘤細(xì)胞和紅細(xì)胞分開，CD34染色管壁細(xì)胞則為陰性，提示管壁細(xì)胞不屬于內(nèi)皮細(xì)胞。試驗(yàn)組有28例存在VM，陽(yáng)性率為25.45%，對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)VM，見圖1。

2.2VM與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 VM陽(yáng)性表達(dá)與患者年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)，與腫瘤大小、病理分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 VM和乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3COX-2在乳腺組織的表達(dá) COX-2在試驗(yàn)組有71.2%(79/110)的陽(yáng)性表達(dá)率，對(duì)照組組織中有20.0%(6/30)的陽(yáng)性表達(dá)率，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

A：COX-2在試驗(yàn)組組織中表達(dá)(箭頭示)；B：COX-2在對(duì)照組組織中無(wú)表達(dá)

圖2 COX-2在乳腺組織的表達(dá)(SP，×200)

2.4COX-2與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 COX-2在乳腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)與患者的年齡和腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05)，與病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 COX-2與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

2.5VM與COX-2關(guān)系 28例乳腺癌VM陽(yáng)性患者中，COX-2陽(yáng)性表達(dá)28例，陽(yáng)性率為100.0%；在82例乳腺癌VM表達(dá)陰性的患者中有58例COX-2陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為70.7%；COX-2在VM陽(yáng)性患者中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于VM陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

VM局部浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤十分重要的生物學(xué)特性，也是決定患者預(yù)后的重要因素，決定這些生物學(xué)特性的基礎(chǔ)之一就是血供，公認(rèn)的腫瘤血液供應(yīng)來(lái)源于血管生成，直到FOLBERG 等[4]在惡性黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)了一種全新的血供方式。這種方式的特點(diǎn)為管道內(nèi)面無(wú)血管內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋，而是被覆模擬血管生成的腫瘤細(xì)胞，通過(guò)與細(xì)胞外的基質(zhì)相互作用，與存在的血管聯(lián)系起來(lái)，從而為惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供更多的血液來(lái)源。近年研究發(fā)現(xiàn)，其他腫瘤組織中也有VM存在，如肺癌[5]、子宮頸癌[6]、卵巢癌[7]等。本研究結(jié)果顯示，110例乳腺癌組織通過(guò)CD34和PAS雙重染色，其中28例證實(shí)VM存在，與SHIRAKAWA等[8]研究結(jié)果一致。近年關(guān)于VM與腫瘤臨床病理特征相關(guān)性的研究中，LIU等[9]對(duì)肝癌的研究發(fā)現(xiàn)VM與腫瘤大小、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有著密切聯(lián)系，本研究也發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中也具有這一特點(diǎn)。

COX-2在正常組織細(xì)胞中多不表達(dá)或低表達(dá)，但在多種上皮來(lái)源腫瘤中因環(huán)境誘導(dǎo)而出現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象。有關(guān)研究表明，COX-2在食管癌等多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象，此現(xiàn)象與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10]。在本研究中，COX-2在乳腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于乳腺良性病變組織。COX-2與乳腺癌臨床病理特征有關(guān)，病理分化越低，COX-2表達(dá)反而越高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織COX-2陽(yáng)性表達(dá)率高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組，而與患者年齡、腫瘤大小無(wú)關(guān)。因此，檢測(cè)COX-2的表達(dá)，可以評(píng)估乳腺癌患者的預(yù)后，臨床上可抑制COX-2的表達(dá)，對(duì)分化程度低、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者進(jìn)行臨床干預(yù)。

研究表明，COX-2可促進(jìn)前列腺素E2(PGE2)的表達(dá)，PGE2與其受體EP3結(jié)合后通過(guò)蛋白激酶C(PKC)，激活ERK1/2，調(diào)控VM生成[11]。JANA等[12]研究表明，表達(dá)COX-2的乳腺癌組織VM表達(dá)為陽(yáng)性，通過(guò)抑制COX-2的表達(dá)能夠使VM的表達(dá)被抑制，說(shuō)明COX-2是促進(jìn)VM形成的一個(gè)重要因素。本研究顯示，COX-2在VM陽(yáng)性患者中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于VM陰性患者，兩者在乳腺癌組織中的表達(dá)有相關(guān)性，說(shuō)明在乳腺癌VM形成過(guò)程中，COX-2起著重要作用。

本課題組下一步擬通過(guò)siRNA技術(shù)靶向沉默COX-2基因的表達(dá)，應(yīng)用PCR、Western blot等技術(shù)檢測(cè)基因沉默后VM的表達(dá)，為后續(xù)研究干擾VM的形成，阻斷惡性腫瘤生長(zhǎng)的血液供應(yīng)提供新思路，并為惡性腫瘤的基因治療尋找新的方向。