傅文婷,趙文忠,江惠華,李銘臻,周冰燚,顧 恒,朱志勇,劉 舒

(1.廣東省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所/廣東省計劃生育專科醫(yī)院生殖免疫與遺傳中心,廣州 510700；2.廣東省婦幼保健院兒童遺傳代謝內(nèi)分泌科,廣州 510010)

染色體平衡易位是指兩條非同源染色體斷裂片段互相交換，未伴隨遺傳物質(zhì)的增加或減少，攜帶者通常臨床表型正常，但經(jīng)減數(shù)分裂可形成遺傳物質(zhì)不平衡的配子，導(dǎo)致攜帶者出現(xiàn)反復(fù)流產(chǎn)、不孕不育、死胎，即便胎兒出生，也大多出現(xiàn)多發(fā)畸形、發(fā)育遲緩等。一般情況下，每個易位攜帶者染色體發(fā)生斷裂的位點(diǎn)不盡相同；在不同個體中反復(fù)出現(xiàn)的復(fù)發(fā)性平衡易位主要為羅伯遜易位，涉及的染色體主要包括13、14、15、21、22 號端著絲粒染色體，是由于它們之間整臂互換而形成的。非羅伯遜易位的復(fù)發(fā)性平衡易位在國內(nèi)少有報道。本文報道11例斷裂位點(diǎn)均位于11號染色體長臂q23和22號染色體長臂q11區(qū)帶的t(11;22)(q23;q11)易位，其中10例為平衡易位，1例為不平衡易位。通過文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，對此較罕見的非羅伯遜易位型復(fù)發(fā)性染色體易位的發(fā)生機(jī)制和異常核型與臨床表型之間的關(guān)系進(jìn)行了總結(jié)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2012年7月至2015年7月因不孕不育、反復(fù)流產(chǎn)、出生畸形兒等不良生育史于本院就診，并確診為t(11;22)(q23;q11)染色體易位的11例患者的臨床資料，完善遺傳學(xué)、內(nèi)分泌、影像學(xué)等相關(guān)檢測。本研究已取得患者知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2方法

1.2.1外周血染色體核型分析

1.2.1.1染色體G顯帶核型分析 (1)接種：采用細(xì)胞增殖同步化方法，取肝素鈉抗凝的臍靜脈血0.5 mL，加入含20%小牛血清(美國Invitrogen,Gibco公司)的RPMI1640培養(yǎng)基液，每個患者培養(yǎng)2瓶；(2)培養(yǎng)：置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)68 h；(3)收獲：收獲前2 h加入40 μL濃度為100 μg/mL的秋水仙素，繼續(xù)培養(yǎng)20 min，離心棄去上清液后，加入氯化鉀溶液9 mL，混勻。 37 ℃水浴箱中溫育25 min。離心去上清液后，加入固定液，混勻。離心去上清液后，加入固定液9 mL，加蓋，顛倒混勻；(4)制片：室溫放置30 min，離心，重復(fù)兩次固定后，常規(guī)制片；(5)顯帶：60 ℃烤片過夜后，放入2%的胰酶消化30 s，再用吉姆薩染液染2 min，完成顯帶步驟。

1.2.1.2結(jié)果判讀 制好的片用Metasystem全自動掃描儀(德國)掃描，在分析軟件上分析，記數(shù)20個細(xì)胞，如果懷疑嵌合體，則加數(shù)到100個細(xì)胞，分析5個核型，核型描述遵循《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制》(ISCN2015)。

1.2.2Y染色體微缺失基因檢測 (1)DNA 的提取。按照QIAGEN 全血DNA提取試劑盒說明書提取DNA；(2)多重PCR和瓊脂糖凝膠電泳。設(shè)計15對PCR引物擴(kuò)增 AZF區(qū)域的15個STS序列標(biāo)簽同時設(shè)計1對PCR引物擴(kuò)增SRY基因，作為內(nèi)控。擴(kuò)增產(chǎn)物用凝膠電泳進(jìn)行檢測分析。

1.2.3微陣列比較基因組雜交(aCGH)檢測

1.2.3.1aCGH檢測方法 (1)DAN提取。采用Topure試劑盒(上海Gene Tech公司)，常規(guī)抽提外周血DNA；(2)酶切。使用Progema限制性內(nèi)切酶，用1%瓊脂糖電泳檢測；(3)標(biāo)記。用康為試劑微量PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化DNA，洗脫體積30 μL；(4)雜交。應(yīng)用Agilent標(biāo)記試劑盒熒光標(biāo)記DNA；(4)洗脫。Wash Buffer 1濃度為0.005%，將水浴鍋調(diào)到42 ℃，預(yù)熱Wash Buffer 2 到37 ℃后洗脫。比較基因組芯片雜交用Agilent Human Genome CGH Microarray 240K芯片(美國Agilent Technologies公司)。

1.2.3.2數(shù)據(jù)分析 熒光圖像由Aglient芯片掃描儀獲取，通過Agilent DNA Analytics軟件(美國)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、計算產(chǎn)生每個位點(diǎn)的基因型或信號相對強(qiáng)度。男女性對照DNA樣本購自美國Invitrogen公司。

2 結(jié) 果

2.1臨床特點(diǎn) 本研究對象為確診t(11;22)(q23;q11)染色體易位患者共11例，其中女7例，男3例，產(chǎn)前診斷1例。7例女性中，病例1、2、3、5和6表現(xiàn)為反復(fù)孕早期自然流產(chǎn)，病例8曾孕小頭、心臟異常和生殖器畸形胎兒；病例4為不孕，B超示子宮附件無異常，促卵泡成熟激素、黃體生成激素、雌二醇無異常；3例男性中，病例9表現(xiàn)為無精子癥；病例10和11為精子數(shù)目減少和活力下降；病例7為產(chǎn)前診斷病例，胎兒超聲檢查提示多發(fā)畸形(圖1)，病例8為病例7的母親，其余患者彼此之間無親緣關(guān)系，家庭其他成員無類似疾病史。

2.2染色體G顯帶核型分析 染色體核型分析提示，10例成人患者均為t(11;22)(q23;q11)染色體平衡易位，1例產(chǎn)前診斷胎兒核型為非平衡易位。患者核型見圖2。

2.3Y染色體微缺失檢測 3例無精/少弱精子癥男性患者(病例9、10、11)的AZF基因15個STS位點(diǎn)未見缺失。見圖3。

2.4aCGH檢測aCGH提示病例7的11號染色體q23.3-q25存在約17.1 Mb片段重復(fù)(arr11q23.3q25(116,655,121-133,715,345)×3)，包含384個功能基因；22號染色體q11.1-q11.21存在約4.8 Mb片段重復(fù)(arr22q11.1q11.21(16,053,473-20,832,003)×3)，包含182個功能基因。其余病例aCGH檢測均未發(fā)現(xiàn)異常。

A：胎兒染色體核型分析；B、C、D：胎兒B超結(jié)果

圖1病例7 G顯帶核型分析圖、染色體拷貝數(shù)異常模式圖及三維彩超圖

A：男性患者染色核型圖；B：女性患者染色體核型圖；C：染色體易位斷裂點(diǎn)模式圖；D：易位染色體核型圖。D1：胎兒易位染色體核型簡圖(不平衡易位)，D2～D6:成人易位染色體核型簡圖(平衡易位)

圖2 t(11;22)(q23;q11)患者的G-顯帶核型圖及模式圖

M：正常男性；1、2、3：3個患者；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ：PCR反應(yīng)體系管

圖3 3例精子生成異常男性患者的SRY及Y染色體STS位點(diǎn)基因檢測結(jié)果圖

3 討 論

t(11;22)染色體平衡易位是人類最常見的非羅伯遜易位型復(fù)發(fā)性易位，攜帶者通常表型正常,往往由于多次流產(chǎn)、不育或生育過Emanuel綜合征患兒而被發(fā)現(xiàn)。t(11;22)(q23;q11)發(fā)生頻率為1/10 000～1/4 000，國內(nèi)僅有為數(shù)不多的案例報道。

染色體易位一般是隨機(jī)出現(xiàn)的，斷裂點(diǎn)區(qū)域的基因組成很可能是導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定的原因，11q23 和22q11 斷裂點(diǎn)均為回文AT富集的重復(fù)序列(PATRRs),由一段長AT序列后接反轉(zhuǎn)序列組成，這種序列容易形成發(fā)夾十字形結(jié)構(gòu)，通過一系列過程導(dǎo)致重組發(fā)生[1-3]。本文中除病例8和病例7是母子關(guān)系外。其余10例t(11;22)(q23;q11)易位患者間無親緣關(guān)系，但染色體斷裂位點(diǎn)一致。

染色體平衡易位攜帶者由于沒有遺傳物質(zhì)丟失，本身可無臨床癥狀；但平衡易位攜帶者配子形成過程中同源染色體片段彼此配對，形成四射體，后者通過鄰位-1式、2式分離及12種可能的3∶1分離，可形成至少18種配子。這些配子分別與正常配子結(jié)合后，可形成18種類型的合子，其中僅1種為正常者，1種為平衡易位攜帶者；其它類型均為部分單體或部分三體，因為遺傳物質(zhì)的不平衡，最終結(jié)局只可能是流產(chǎn)、死產(chǎn)、新生兒死亡、生育畸形兒等[3-4]。t(11;22)(q23;q11)平衡易位攜帶者多由于反復(fù)不良生育史，最后進(jìn)行染色體核型分析才被發(fā)現(xiàn)。當(dāng)平衡易位攜帶者46,XY或XX,t(11;22)(q23;q11)生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中，粗線期交叉的不對稱性，導(dǎo)致第1次減數(shù)分裂中期四射體方向的不調(diào)和，使之在減數(shù)分裂的后期偏向于3∶1分離。這種情況下當(dāng)正常配子與24,X或24,Y,+der(22)t(11;22)(q23;q11)配子結(jié)合，就有機(jī)會形成核型為47,XY或47,XX,+der(22)t(11;22)(q23;q11)的合子[5,6]，即為本文其中一例胎兒出現(xiàn)額外der(22)t(11;22)。額外der(22)t(11;22)綜合征患兒額外攜帶了1條衍生22號染色體，這會引起遺傳物質(zhì)的不平衡，導(dǎo)致出現(xiàn)臨床癥狀。該綜合征的臨床特點(diǎn)為耳廓大而松軟、耳位低、小頭畸形或頭顱不對稱、高腭弓、小頜、心臟畸形、生殖器畸形、癲癇發(fā)作等[7]。額外der(22)t(11;22)綜合征患兒常在新生兒期死亡，極少能存活至兒童早期，少數(shù)存活者，也伴發(fā)有精神運(yùn)動遲緩、肌張力低下、骨關(guān)節(jié)畸形、胰腺發(fā)育不良等嚴(yán)重癥狀，生活不能自理[8-9]。

有文獻(xiàn)報道，母親為t(11;22)(q23;q11)平衡易位攜帶者產(chǎn)生異常后代的可能性顯著高于父親是平衡易位攜帶者[10]。推測這種差異與精母細(xì)胞、卵母細(xì)胞在減數(shù)分裂時的形式不同有關(guān)：精子數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過卵子，精卵結(jié)合時，攜帶異常染色體的精子被排斥，正常精子優(yōu)先受精；而女性平衡易位攜帶者卵子則無選擇機(jī)會。病例7在母親孕期檢測到唐氏高風(fēng)險，B超提示胎兒單臍動脈、腦中線囊腫，右腎發(fā)育不良，心包積液，孕25周進(jìn)一步行臍帶血穿刺胎兒染色體核型分析發(fā)現(xiàn)der(22)t(11;22)綜合征胎兒，經(jīng)遺傳咨詢，胎兒父母選擇終止妊娠。復(fù)查胎兒父母外周血核型而發(fā)現(xiàn)母親(病例8)為平衡易位攜帶者。先證者父母之一為 t(11;22)攜帶者，再次妊娠有以下幾種可能：(1)der(22)綜合征；(2)t(11;22)攜帶者；(3)自然流產(chǎn)。再發(fā)風(fēng)險依賴于先證者的父親還是母親為平衡易位攜帶者。一般女性攜帶者再發(fā)風(fēng)險5.7%～6.1%，略高于男性攜帶者的2.2%～5.0%[11]。因此，對于發(fā)生頻率相對較高的t(11;22)(q23;q11)復(fù)發(fā)性染色體平衡易位，父母染色體的分析有助于了解標(biāo)記染色體的組成，進(jìn)而揭示患兒臨床表現(xiàn)的遺傳學(xué)病因，為遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。