刁愛芹,王 卉,潘愛萍,李曉潔,周瑞芳,陳國富

(泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇泰州 225300)

心肌肥厚是心臟長期負(fù)荷過重的一種代償性反應(yīng),各種致心肌肥厚因素通過心臟細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑改變相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子的活性，導(dǎo)致心臟組織中大量基因/蛋白質(zhì)的表達(dá)出現(xiàn)異常，是以心臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化為特征的心室重構(gòu)[1]，是多種心血管系統(tǒng)疾病常見的一種并發(fā)癥，常導(dǎo)致心力衰竭，如何預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)已成為當(dāng)今治療的重要目標(biāo)。大豆異黃酮(SI)即大豆苷元是一種異黃酮類化合物，研究發(fā)現(xiàn)其具有雌激素樣作用、抗心肌缺血-再灌注損傷作用、抗心衰作用、對過氧化氫誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用等[2-4]。周茜等[5]研究表明SI對壓力負(fù)荷性大鼠心肌肥厚具有保護(hù)作用。本研究采用主動脈弓縮窄(TAC)法致壓力負(fù)荷性心肌肥厚模型，探討SI對心肌肥厚的保護(hù)作用機(jī)制，旨在為SI在心肌肥厚防治中的作用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量210～260 g，由揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.1.2藥品 SI(華北制藥股份有限公司)，異黃酮總含量大于或等于98%，Masson染色試劑盒購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，TLR4抗體、MyD88抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2試驗方法

1.2.1大鼠心肌肥厚模型建立 將大鼠分成4組：假手術(shù)組(Sham組)、主動脈弓縮窄模型組(TAC組)、溶劑對照組(TAC+placebo組)和SI治療組(TAC+SI組)。參照文獻(xiàn)[6]方法制備大鼠心肌肥厚模型。3.6%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔麻醉后，經(jīng)氣管插管與動物呼吸機(jī)鏈接。胸部左側(cè)第三肋間隙打開胸腔，在左頸總動脈與頭臂干之間穿一0號絲線，并緊貼其上置一10號針頭，用絲線將動脈與針頭一起扎緊并迅速抽出針頭，按照統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)造成不完全縮窄。假手術(shù)對照組除不進(jìn)行縮窄外，其余手術(shù)步驟與其他組相同。TAC+SI組大鼠于造模第2天開始分別灌胃給藥120 mg/(kg·d)，連續(xù)4周，TAC+placebo組每天灌胃相同體積的溶劑，藥物臨用時溶于0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶劑中。

1.2.2標(biāo)本收集和處理 術(shù)后4周，末次給藥后禁食12 h大鼠稱質(zhì)量后處死，取其心臟，去除大血管、心外膜脂肪組織，用生理鹽水清洗，吸干后計算全心質(zhì)量指數(shù)(HW/BW)和左心室質(zhì)量指數(shù)(LVW/TL)。

1.2.3組織學(xué)染色 心肌組織膠原及纖維組織的鑒定染色(Masson染色)，取大鼠心臟新鮮組織置于10%甲醛溶液固定，石蠟切片，根據(jù)Masson染色試劑盒說明書，進(jìn)行心肌組織染色，通過光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織膠原沉積情況。蘇木素(HE)染色，取大鼠心臟新鮮組織置于10%甲醛固定，脫蠟脫水處理。置入HE染核3～5 min，自來水洗5 min共3次，1%鹽酸乙醇分化 0.5～1 min，流水沖洗5 min共3次，氨水反藍(lán)1 min，流水沖洗15 min。0.5%伊紅水溶液(對比染色)，95%乙醇、無水乙醇脫水，透明，封固，通過顯微鏡觀察心肌細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4免疫共沉淀(immunoprecipatation，IP) 每組取細(xì)胞質(zhì)蛋白300 μg，用Lysis Buffer補(bǔ)足體積至150 μL，加入TLR4抗體5 μL，4 ℃持續(xù)混合過夜后再加入 Protein-A agrose 20 μL，4 ℃充分混合1 h，離心棄上清液。沉淀用Lysis Wash Buffer洗3次，同樣方法離心后再用20 μL的Lysis Buffer混旋沉淀，加4 μL 6×SDS Loading Buf,煮沸3 min后收集上清液Western blot方法分析MyD88及TLR4蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1SI對TAC術(shù)后心臟外觀變化 從圖1可見，雄性SD大鼠進(jìn)行TAC后4周，其心臟發(fā)生明顯肥大，與Sham組相比，HW/BW和LVW/TL的值顯著升高(t=4.344,P=0.012 2和t=8.762,P=0.000 9,n=6)；TAC+placebo組HW/BW和LVW/TL與TAC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.222 7,P=0.834 7和t=0.519 6,P=0.630 8,n=6)，與Sham組比較明顯升高(t=3.375,P=0.027 9和t=6.640,P=0.002 7，n=6)；而TAC+SI組心臟大小與TAC組相比，HW/BW和LVW/TL的值顯著降低(t=3.432,P=0.026 5和t=5.738,P=0.105，n=6)。

圖1 TAC誘導(dǎo)的雄性SD大鼠的心室肥大

A:各組HW/BW比較;B:各組LVW/TL比較;*：P<0.05，與Sham組比較；#：P<0.05，與TAC組、TAC+placebo組比較

圖2 TAC誘導(dǎo)的SD大鼠心臟質(zhì)量改變

圖3 TAC后4周心肌組織的形態(tài)學(xué)改變(HE×400,Masson×100)

2.2SI對TAC術(shù)后心肌形態(tài)學(xué)和心肌纖維化變化 與Sham組比較，TAC組的心肌組織細(xì)胞間隙中的纖維結(jié)締組織明顯增多。使用SI處理4周的TAC+SI組，心肌組織內(nèi)纖維結(jié)締組織與 TAC組相比則明顯減少，TAC+placebo組心肌組織內(nèi)膠原含量與TAC組相比則沒有明顯改變。對左心室心肌組織進(jìn)行常規(guī)切片，Sham組心肌結(jié)構(gòu)正常，TAC組心肌細(xì)胞直徑增寬，肌纖維排列紊亂。使用SI治療4周后，心肌細(xì)胞橫截面積減小，而TAC+placebo組4周后的心肌細(xì)胞橫截面積仍顯著增加，肌纖維排列紊亂。見圖3。

A:Western blot圖;B：TLR4和MyD88蛋白相互結(jié)合統(tǒng)計分析;*：P<0.01，與Sham組比較；#：P<0.01與TAC組、TAC+placebo組比較；IP：免疫共沉淀；IB：Western blot檢測

圖4 SI抑制TAC引起的大鼠心臟TLR4對MyD88相互作用

2.3SI抑制 TAC引起的TLR4對MyD88招募的增加 TAC后4周，TAC組大鼠左心室心肌組織TLR4與MyD88的結(jié)合與Sham組相比明顯增加(t=16.07,P=0.003 9,n=6)；TAC+placebo組與TAC組比較無明顯變化(t=1.761,P=0.220 2,n=6)，給予SI治療后，TAC后4周心室心肌組織TLR4與MyD88的結(jié)合與TAC+placebo組顯著降低(t=13.88,P=0.005 1,n=6)。見圖4。

3 討 論

TAC可引起大鼠壓力超負(fù)荷性心肌肥厚和心室重構(gòu)。本實驗?zāi)Ｐ徒M的心臟質(zhì)量指標(biāo)(HW/BW和LVW/TL)明顯增加、Masson染色和HE染色顯示的形態(tài)學(xué)指標(biāo)均高于Sham組，SI治療后可抑制心臟質(zhì)量及形態(tài)學(xué)指標(biāo)，說明SI可減輕TAC所致的大鼠心肌肥厚。

SI是大豆生長形成的一類次生代謝產(chǎn)物，它包括15種結(jié)構(gòu)類似的化合物，主要包括染料木黃酮、大豆素苷元和大豆苷元等，其中燃料木黃酮的活性最高。SI的結(jié)構(gòu)與雌激素相似，在體內(nèi)它可以與雌激素受體結(jié)合發(fā)揮弱的雌激素樣作用而不攜帶雌激素的不良反應(yīng)，被認(rèn)為是天然的雌激素替代品。流行病學(xué)研究證實SI在女性心血管疾病的發(fā)病和預(yù)防治療中起重要作用[2，6]。也有研究表明，SI對腹TAC所致心肌肥厚大鼠心室重構(gòu)有一定的保護(hù)作用，然而具體的作用機(jī)制還不是很清楚，從而限制了臨床應(yīng)用SI治療或預(yù)防心血管疾病[5]。

Toll樣受體是天然免疫系統(tǒng)內(nèi)重要的模式識別受體。在這些受體中，TLR4可被內(nèi)毒素、熱休克蛋白60、纖維連接素等多種外源性或內(nèi)源性配基激活，招募髓樣分化蛋白88(MyD88)，誘導(dǎo)MyD88下游的核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)與 NF-κB的抑制蛋白IκBα(inhibitor of NF-κB)解離，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，編碼不同肥大基因的轉(zhuǎn)錄活化及炎癥因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)心肌細(xì)胞的肥大程度及凋亡。TLR4信號通路的激活源于細(xì)胞質(zhì)TIR域，在LPS等配基的刺激下，TLR4通過TIR域與MyD88的TIR域相結(jié)合，MyD88被激活后，通過死亡域招募下游的IL-1受體相關(guān)激酶(IRAKs)，誘導(dǎo)下游的兩條不同的信號通路，最終分別激活c-Jun氨基末端激酶和NF-κB，其中，NF-κB進(jìn)入核內(nèi)參與調(diào)控基因的表達(dá)。這些改變可能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的病理性肥大及細(xì)胞色素c的缺失等細(xì)胞表型的改變。文獻(xiàn)[7-8]研究發(fā)現(xiàn)TLR4/MyD88介導(dǎo)的NF-κB信號通路在壓力負(fù)荷增加或纖維蛋白原誘導(dǎo)心肌肥大過程中發(fā)揮重要作用，TLR4基因缺陷小鼠與對照組相比，TAC誘導(dǎo)的心肌肥大的程度與野生型小鼠相比明顯減輕；而心肌局部轉(zhuǎn)染MyD88無效抑制因子(Ad5-dn-MyD88 )特異性抑制MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)亦能夠明顯減少TAC或纖維蛋白原誘導(dǎo)的心肌肥大發(fā)生、發(fā)展過程中NF-κB的活化，減輕心肌肥大，改善心臟功能。

有資料表明，天然雌激素對心肌肥大具有保護(hù)作用，并且能降低LPS誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞系中的TLR4 mRNA的表達(dá)[9-11]。另外有研究發(fā)現(xiàn),在表皮角質(zhì)細(xì)胞中，天然雌激素可以降低創(chuàng)傷性出血誘導(dǎo)的TLR4與MyD88的蛋白表達(dá)水平及下游的信號級聯(lián)反應(yīng)[12-13]。LOU等[14]研究表明在脫膜間質(zhì)細(xì)胞中雌激素能下調(diào)LPS激活的TLR4信號通路發(fā)揮抗炎抗凋亡作用，這些研究結(jié)果提示天然雌激素可能通過影響TLR介導(dǎo)的信號通路發(fā)揮其免疫保護(hù)作用。SI作為天然雌激素的替代品，在本實驗中發(fā)現(xiàn)SI能抑制TAC誘導(dǎo)的大鼠心肌組織內(nèi)TLR4/MyD88交互作用增加，從而影響下游信號通路，抑制TAC誘導(dǎo)的心肌肥大的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，SI可抑制壓力超負(fù)荷導(dǎo)致的心肌肥厚和心室重構(gòu)，而這種作用可能與抑制TLR4/MyD88介導(dǎo)的心肌肥厚信號通路有關(guān)，有關(guān)作用機(jī)制還有待深入研究。