劉曉健 陳睿琦 胡 峰 張秀冰 曾慶紅 王 藝 崔秀玲

(錦州醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001)

自噬基因微管相關(guān)蛋白1輕鏈(LC)3是自噬的標(biāo)志物，自噬形成時(shí)，胞漿型LC3(LC3-Ⅰ)會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w膜型(LC3-Ⅱ)。研究表明在多種疾病的發(fā)生發(fā)展與治療過(guò)程中均可有自噬水平的變化〔1,2〕。糖尿病(DM)心肌病是DM的重要并發(fā)癥。Lee等〔3〕研究表明，持續(xù)的高糖環(huán)境心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯自噬，可能促進(jìn)DM心肌病的發(fā)生。而另有學(xué)者認(rèn)為DM心肌中自噬不足促進(jìn)了DM心肌病的發(fā)生發(fā)展，增強(qiáng)自噬可延緩心功能的損傷〔4,5〕。Xu等〔6〕報(bào)道心肌中自噬潮的減少是DM過(guò)程中的一種適應(yīng)性反應(yīng)，有自噬缺陷的DM心肌損傷反而減弱，增加自噬卻加重了DM心肌損傷。Kanamori等〔7〕報(bào)道Ⅱ型DM小鼠心肌中自噬減少，而Ⅰ型DM小鼠心肌中自噬卻增多。本研究探討DM心肌損傷過(guò)程中自噬的變化。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及模型建立 健康雄性SD大鼠125只(購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，SYXK(遼)2014-0010)，8周齡，體重(245±20)g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，對(duì)照組(NC組)49只注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；DM模型組(DM組)86只以尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ)50 mg/kg，于注射后72 h測(cè)定空腹血糖(FBG)，以FBG≥16.7 mmol/L作為DM大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)。造模成功72只，最終死亡8只，有1只出籠和16只因飼養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)血糖回落于標(biāo)準(zhǔn)以下被剔除。飼養(yǎng)期間，所有動(dòng)物自由飲水、進(jìn)食，每周監(jiān)測(cè)體重和尾靜脈血葡萄糖等情況。兩組分別在成模后第10、20、30、40、60、80、100天，以1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，結(jié)束動(dòng)物飼養(yǎng)。

1.2心肌標(biāo)本收集 麻醉狀態(tài)下迅速取出大鼠心臟，預(yù)冷的生理鹽水洗去血液，濾紙吸干水分，稱量心臟重量，計(jì)算心重指數(shù)(心臟/體重，mg/g)。分離左心室組織，取部分心肌組織快速放入-80℃冰箱凍存，待測(cè)蛋白表達(dá)。另取一部分左心室組織放入新配制的4%多聚甲醛固定液中，待進(jìn)行石蠟切片的形態(tài)學(xué)檢測(cè)。

1.3心肌組織病理學(xué)檢測(cè) 取石蠟包埋切片，行普通蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡觀察兩組各時(shí)間點(diǎn)心肌組織形態(tài)學(xué)改變。

1.4Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 冰上操作眼科剪刀剪碎心肌組織后，加入含有1%蛋白酶抑制劑cocktail(美國(guó)Sigma公司)的RIPA裂解液(碧云天試劑公司)，超聲碎裂組織后再在冰上裂解40 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min。取上清，二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白定量。與5倍樣品緩沖液混合后,煮沸5 min。各個(gè)樣品取等量總蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯凝膠中電泳后轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用1%牛血清白蛋白(BSA)封閉2 h后,按預(yù)染Marker標(biāo)記的分子量剪裁轉(zhuǎn)印膜，分別加入甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(美國(guó)Santa Cruz公司)、LC3B抗體(美國(guó)Sigma公司)，4℃搖床孵育過(guò)夜。二抗(1∶8 000稀釋)室溫作用1 h后，電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯色，GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)照相并分析處理。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行ANOVA 和LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組體重、FBG水平變化 DM組在造模后體重不再增加，甚至呈現(xiàn)明顯減少，多食、多飲，多尿、時(shí)有稀便，毛色暗淡，病程達(dá)60 d后，個(gè)別大鼠開始出現(xiàn)眼睛發(fā)白，80 d后，多數(shù)大鼠有明顯的眼睛白色變。NC組一切正常，毛色光亮，體格健康，無(wú)死亡，見表1。

2.2兩組不同時(shí)期心重指數(shù)比較 隨著鼠齡的增長(zhǎng)，NC組心重指數(shù)稍有降低，而DM組明顯升高。40 d開始，與同時(shí)間點(diǎn)NC組相比，DM組心重指數(shù)顯著增加(P<0.01，P<0.05)，見表1。

2.3兩組心肌組織形態(tài)學(xué)變化 NC組各時(shí)間點(diǎn)心肌組織的HE染色，在光鏡下觀察未見顯著差別，心肌纖維走行整齊而致密。DM組在20 d時(shí)，心肌纖維走行基本整齊，與NC差別不明顯；而在40 d時(shí)，偶見心肌纖維分布較疏松，走行稍有紊亂或呈收縮狀改變；在80 d時(shí)，心肌纖維分布疏松和紊亂更為顯著，見圖1。

表1 兩組體重、FBG、心重和心重指數(shù)比較

與同時(shí)間點(diǎn)NC組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

圖1 兩組心肌組織HE染色(×400)

2.4兩組心肌組織中LC3-Ⅱ表達(dá) NC組隨鼠齡的增加，心肌組織中LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)呈現(xiàn)增多的趨勢(shì)，10 d時(shí)1.00±0.00，20 d 1.11±0.11，30 d 1.11±0.08，40 d 1.27±0.12，60 d 1.49±0.08，80 d 1.52±0.12，100 d 1.58±0.15，從40 d開始與第10天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。DM組隨著病程的發(fā)展，LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)表現(xiàn)為先稍增加，10 d 1.00±0.00,20 d 1.06±0.07,30 d 1.08±0.07,40 d 0.93±0.07，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而后明顯減弱，60 d 0.83±0.07,80 d 0.72±0.08,100 d 0.67±0.08(P<0.05,P<0.01)。與相同時(shí)間點(diǎn)NC組比較，DM組心肌組織中LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)在20 d時(shí)有增多趨勢(shì)(1.00±0.00 vs 1.13±0.05)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.059 7)；40 d呈現(xiàn)降低趨勢(shì)(1.15±0.03 vs 1.10±

0.04)，較20 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，至80 d時(shí)DM組(0.76±0.02)明顯低于NC組(1.38±0.05，P<0.01)，見圖2，圖3。

圖2 兩組不同時(shí)間點(diǎn)心肌組織LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)

圖3 兩組心肌組織LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)比較

3 討 論

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，DM心肌病臨床發(fā)生率約75%，但其發(fā)生機(jī)制尚未完全明了。目前研究認(rèn)為，早期DM心肌病發(fā)生主要是由于線粒體損傷、細(xì)胞能量代謝異常、脂毒性、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、細(xì)胞凋亡等機(jī)制參與，而氧化應(yīng)激參與(DC)發(fā)生發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)〔7，8〕。

自噬過(guò)程是維持細(xì)胞合成、分解和結(jié)構(gòu)重復(fù)利用必不可少的步驟。它不僅僅幫助細(xì)胞實(shí)現(xiàn)氨基酸的再循環(huán)，也幫助清除受損的細(xì)胞器，因而消除氧化應(yīng)激，使細(xì)胞重塑而生存。LC3最初合成為未加工的形式pro-LC3，被轉(zhuǎn)化成酶處理的形式LC3-Ⅰ，最終被修改成PE共軛的形式LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ是自噬小體結(jié)構(gòu)可信賴的蛋白質(zhì)標(biāo)志〔9〕。

本研究結(jié)果顯示，DM組心肌組織中LC3的蛋白表達(dá)顯著減少，表明自噬水平降低，與近來(lái)較多研究結(jié)果一致〔4,6〕。本研究結(jié)果還顯示，正常的大鼠隨著鼠齡增長(zhǎng)，心肌組織中LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)增多，與Xu等〔6〕報(bào)道不一致，可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類和年齡不同有關(guān)。關(guān)于自噬水平在DM心肌病變中作用的不同結(jié)論，可能與不同齡的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物DM模型有關(guān)，Lee等〔3〕以幼年動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，結(jié)果顯示自噬促進(jìn)了DM心肌病變的發(fā)展。

本研究結(jié)果提示隨著DM的病程發(fā)展，心肌組織難以維持一定水平的自噬，可能正是由于自噬的明顯減少，DM大鼠的心肌組織不能實(shí)現(xiàn)氨基酸的再循環(huán)及清除受損的細(xì)胞器，不能使細(xì)胞有效重塑，從而出現(xiàn)顯著的心肌組織損傷。