張瀾川 李 然 劉立萍

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110032)

骨質(zhì)疏松(OP)是一種與年齡密切相關(guān)的疾病，SAMP6快速老化小鼠是一種研究老年性骨質(zhì)疏松(SOP)理想的動物模型，股骨及其他組織的病理改變與老年病理狀態(tài)相似，可將其應(yīng)用于SOP等老年性疾病的基礎(chǔ)研究。腸鈣吸收減少是SOP發(fā)生的重要因素之一〔1〕，十二指腸是參與腸鈣吸收的主要場所〔2〕，十二指腸腸黏膜屏障功能的維護(hù)與腸堿性磷酸酶(ALP)密切相關(guān)。前期研究結(jié)果表明左歸丸含藥血清對成骨細(xì)胞(OB)增殖具有促進(jìn)作用，并提高OB的ALP活性〔3〕。本研究擬分析補(bǔ)腎方與補(bǔ)腎健脾方對SAMP6快速老化模型小鼠十二指腸組織與股骨組織ALP蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取3月齡SPF級雄性未交配SAMP6快速老化模型小鼠24只，SAMR1同源對照小鼠8只，體重(30±2)g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供，動物許可證號：SCXK(京)2011-0012。

1.2主要藥物與試劑 補(bǔ)腎方左歸丸組成：熟地黃24 g，炒山藥、枸杞子、山茱萸、龜板膠、鹿角膠、菟絲子各12 g，川牛膝9 g。補(bǔ)腎健脾方左歸丸合苓桂術(shù)甘湯組成：熟地黃24 g，炒山藥、枸杞子、山茱萸、龜板膠、鹿角膠、菟絲子各12 g，川牛膝9 g，茯苓20 g，桂枝15 g，白術(shù)15 g，炙甘草10 g，均購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，制備水煎劑。購自abcam公司的抗ALP抗體、博奧森公司的抗Ⅰ型膠原(Col1)抗體、Santa Cruz公司的抗β-Actin抗體。

1.3主要儀器 德國Leica石蠟切片機(jī)，日本OLYMPUS顯微鏡，美國Bio-Rad公司Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，美國Protein Simple公司FluorChem Q蛋白質(zhì)印跡成像系統(tǒng)。

1.4方法

1.4.1動物分組 實驗分為SAMR1(對照組)、SAMP6(模型組)、補(bǔ)腎方和補(bǔ)腎健脾方4組各8只。

1.4.2給藥與取材 補(bǔ)腎方與補(bǔ)腎健脾方給藥劑量根據(jù)人與小鼠體表面積等效劑量折算，SAMR1與SAMP6給予等量水，1次/d，連續(xù)給藥12 w，收集各組小鼠十二指腸組織和股骨組織。

1.4.3指標(biāo)檢測 采用蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察各組小鼠十二指腸組織形態(tài)，光學(xué)顯微鏡下觀察和采集圖像；采用Masson染色法，光學(xué)顯微鏡下觀察股骨組織膠原形態(tài)和采集圖像，Masson染色膠原纖維呈藍(lán)色；采用Western印跡法檢測股骨組織Col1蛋白表達(dá)水平；采用免疫組織化學(xué)(SABC) 染色法，光學(xué)顯微鏡下觀察十二指腸與股骨組織ALP蛋白表達(dá)，SABC染色呈棕色至棕黃色染色區(qū)域為陽性表達(dá)區(qū)域。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1補(bǔ)腎方與補(bǔ)腎健脾方對SAMP6小鼠十二指腸組織形態(tài)的影響 對照組十二指腸組織小腸絨毛形成明顯的葉狀突起，表面上皮細(xì)胞完整，黏膜層形態(tài)完好，腺體較為完整，可見清晰的杯狀細(xì)胞。與對照組比較，模型組十二指腸組織小腸絨毛形成的葉狀突起破壞，腸絨毛縮短，表面上皮細(xì)胞受損，腸腺排列紊亂。與模型組比較，給藥組小腸絨毛形成的葉狀突起較為明顯，腸腺排列較整齊，無明顯細(xì)胞損傷。見圖1。

圖1 各組十二指腸組織形態(tài)(HE，×200)

2.2補(bǔ)腎方與補(bǔ)腎健脾方對SAMP6小鼠股骨組織膠原的影響 對照組骨小梁形態(tài)完整，股骨組織膠原面積染色較均一；與對照組比較，模型組骨小梁染色面積減少，膠原染色色淡且不均一；與模型組比較，給藥組骨小梁染色面積均增加，骨小梁著色較均一，有少處著色不均，骨膠原含量明顯增加。見圖2。

圖2 各組股骨組織膠原情況(Masson染色，×200)

2.3補(bǔ)腎方與補(bǔ)腎健脾方對SAMP6小鼠股骨組織Col1蛋白表達(dá)的影響 與對照組(0.94±0.06)比較，模型組股骨組織Col1蛋白表達(dá)(0.81±0.04)明顯下調(diào)(P<0.05)，與模型組比較，補(bǔ)腎方組(0.91±0.04)與補(bǔ)腎健脾方組(0.93±0.02)顯著上調(diào)股骨組織Col1蛋白表達(dá)(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組股骨組織Col1蛋白表達(dá)

2.4補(bǔ)腎方與補(bǔ)腎健脾方對SAMP6小鼠十二指腸組織ALP蛋白表達(dá)的影響 對照組十二指腸組織ALP蛋白表達(dá)較多，陽性表達(dá)區(qū)域廣泛，主要分布于柱狀上皮細(xì)胞及腸腺細(xì)胞的胞質(zhì)中。與對照組比較，模型組十二指腸組織ALP蛋白表達(dá)減少，陽性表達(dá)區(qū)域較小，腸上皮柱狀上皮細(xì)胞損傷。與模型組比較，給藥組可增加十二指腸ALP蛋白表達(dá)，陽性表達(dá)區(qū)域明顯增加，給藥組對ALP蛋白表達(dá)有較為明顯的影響。見圖4。

圖4 各組十二指腸組織ALP蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)

2.5補(bǔ)腎方與補(bǔ)腎健脾方對SAMP6小鼠股骨組織ALP蛋白表達(dá)的影響 對照組股骨組織ALP蛋白表達(dá)較多，在骨髓細(xì)胞中ALP有較為明顯的表達(dá)，且主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中。與對照組比較，模型組股骨組織骨小梁面積減少，骨髓腔面積增大，ALP蛋白表達(dá)明顯的減少，陽性表達(dá)區(qū)域較小。與模型組比較，給藥組可增加股骨組織ALP蛋白表達(dá)，陽性表達(dá)區(qū)域明顯增加，在骨髓腔中和骨小梁骨細(xì)胞中均可見表達(dá)。見圖5。

圖5 各組股骨組織ALP蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)

3 討 論

SOP為低轉(zhuǎn)換型原發(fā)性O(shè)P，與年齡密切相關(guān)。隨年齡增長，伴隨骨代謝激素分泌的轉(zhuǎn)變與骨細(xì)胞功能下降〔4〕。SAMP6快速老化模型小鼠骨量減少，骨密度(BMD)降低，骨微結(jié)構(gòu)被破壞，骨脆性增加，并伴有OB骨形成低下與破骨細(xì)胞骨吸收增強(qiáng)等特點，是研究SOP的理想動物模型〔5〕。SAMP6快速老化模型小鼠較同源對照SAMR1小鼠出現(xiàn)明顯的骨礦含量升高及骨鈣素水平降低，股骨生物力學(xué)性能低下〔6〕。本研究結(jié)果顯示SAMP6快速老化模型小鼠股骨組織出現(xiàn)老化所致的骨小梁面積減少和骨髓腔增大等病理改變。

OP屬中醫(yī)“骨痿”和“骨痹”范疇，《素問·五臟生成篇》云：“腎之合骨也，其榮發(fā)也，其主脾也?！敝嗅t(yī)防治原發(fā)性O(shè)P，多以補(bǔ)腎為主，健脾為輔〔7〕。本研究結(jié)果顯示補(bǔ)腎方與補(bǔ)腎健脾方可有效改善SAMP6快速老化模型小鼠股骨組織的病理改變。

導(dǎo)致OP發(fā)病的重要原因之一是小腸對鈣離子吸收作用的下降，十二指腸是鈣離子吸收的主要部位〔8〕。有研究表明衰老過程中，腸黏膜絨毛出現(xiàn)萎縮，隱窩變淺，腸黏膜完整性被破壞，小腸的消化、吸收、防御等正常生理功能呈現(xiàn)下降的趨勢〔9〕。補(bǔ)腎中藥可增強(qiáng)腸鈣吸收功能〔10〕。本研究結(jié)果提示補(bǔ)腎方與補(bǔ)腎健脾方可有效改善衰老所致的腸上皮細(xì)胞損傷。Col1廣泛存在于骨基質(zhì)中，參與骨礦化過程和維持骨骼完整，在骨細(xì)胞形成與分化中起到重要作用〔11〕。前期研究結(jié)果表明補(bǔ)腎填精方左歸丸可上調(diào)去卵巢大鼠股骨組織Col1蛋白表達(dá)〔12〕。本研究結(jié)果提示補(bǔ)腎方與補(bǔ)腎健脾方可能通過增加骨膠原含量，促進(jìn)骨形成，改善SAMP6快速老化模型小鼠的OP病理狀態(tài)。ALP廣泛存在于人體各臟器組織中，包括肝臟、腎臟、骨骼、腸和胎盤組織中。老年女性多見ALP活性下降，可能與絕經(jīng)后雌激素分泌減少有關(guān)，影響骨質(zhì)的再吸收〔13〕。不同組織亞型的ALP有各自的特性，但所有的ALP都可以使底物去磷酸化。ALP的功能為參與骨骼的鈣化及去鈣化，腸ALP對維持腸道穩(wěn)態(tài)有一定的作用〔14〕。ALP是骨形成和OB分化的標(biāo)志〔15〕，SOP患者血清ALP升高，BMD與ALP呈負(fù)相關(guān)〔16〕。補(bǔ)腎法與補(bǔ)腎健脾法均可有效改善原發(fā)性O(shè)P患者成骨過程，降低血清ALP水平〔17，18〕。腸ALP是一種錨定于腸上皮細(xì)胞頂膜上的糖蛋白，在腸黏膜屏障的維護(hù)中發(fā)揮著重要作用〔19〕。腸黏膜屏障功能受損與臨床多種疾病的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系，腸屏障功能障礙機(jī)制的研究對于臨床相關(guān)疾病的防治有重要意義〔20〕。本研究結(jié)果提示骨形成能力低下，腸黏膜屏障功能受損，SOP的發(fā)生發(fā)展可能與腸黏膜屏障功能紊亂密切相關(guān)；補(bǔ)腎方與補(bǔ)腎健脾方可有效調(diào)節(jié)十二指腸和股骨組織中ALP蛋白表達(dá)，提高OB活性，促進(jìn)骨形成。

綜上，補(bǔ)腎方與補(bǔ)腎健脾方可有效改善SAMP6快速老化模型小鼠股骨組織骨小梁形態(tài)，增加股骨組織膠原含量和上調(diào)Col1蛋白表達(dá)，對SOP具有一定的防治作用；可改善SAMP6快速老化模型小鼠十二指腸組織腸黏膜損傷，上調(diào)十二指腸組織ALP蛋白表達(dá)。補(bǔ)腎方與補(bǔ)腎健脾方可能是通過保護(hù)腸黏膜組織，改善SAMP6快速老化模型小鼠OB功能，防治SOP。