趙志英 高洋洋 高玉娟 高 黎 張 明 姜寒薇

(包頭醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040)

缺血/低氧腦損傷是各種腦血管病發(fā)生發(fā)展形成的病理基礎(chǔ)，缺血/低氧將直接引起腦損傷并導(dǎo)致級聯(lián)病理生理損傷效應(yīng)〔1〕。引起缺血腦損傷的主要機(jī)制之一是細(xì)胞凋亡，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡可減輕腦缺血損傷。尖葉假龍膽提取物具有保肝、抗氧化、抗感染、抗腫瘤等藥理作用〔2〕。雛菊葉龍膽酮(Bellidifolin)是從龍膽科植物中分離提取的口山酮(Xanthones)類化合物，在植物中含量很高，且性質(zhì)穩(wěn)定。高黎等〔3〕發(fā)現(xiàn)，Bellidifolin對缺血性大鼠腦損傷，特別是局灶性腦缺血損傷具有顯著的保護(hù)作用，且其保護(hù)作用的機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激，降低興奮性氨基酸水平和增加γ-氨基丁酸(GABA)含量有關(guān)。也有研究發(fā)現(xiàn)Bellidifolin增加了睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)的釋放，促進(jìn)了坐骨神經(jīng)損傷后的恢復(fù)功能〔3，4〕。細(xì)胞凋亡是多重信號分子的級聯(lián)反應(yīng)，在凋亡的啟動和執(zhí)行過程中需要某些蛋白、蛋白酶的參與。研究證明半胱天冬酶(Caspase)依賴性通路和非Caspase 依賴性通路于細(xì)胞凋亡時發(fā)揮重要作用〔5〕。其中Caspase-3是Caspase級聯(lián)反應(yīng)的最終執(zhí)行者〔6〕，多種刺激因素啟動的凋亡信號激活Caspase-3，切割下游的核酸酶、細(xì)胞骨架、蛋白激酶等，通過使細(xì)胞重要蛋白質(zhì)降解失活，引起細(xì)胞形態(tài)改變導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路被各種細(xì)胞外信號激活，隨后被磷酸化，涉及一系列生理和病理過程，包括細(xì)胞周期調(diào)控，細(xì)胞增殖和凋亡〔7〕。有研究認(rèn)為細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路激活主要是促進(jìn)細(xì)胞存活和抑制凋亡，而JNK和p38MAPK通路的激活主要與細(xì)胞凋亡有關(guān)〔8，9〕。本文擬分析Bellidifolin對缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料 Bellidifolin(純度>98%)購自四川維克奇生物科技有限公司。大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞(PC12)購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。DMEM、RIPA裂解液和馬血清購自美國Gibco公司。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒購自福州邁新生物，兔抗p38MAPK、pERK、β-actin及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購自美國Santa公司，其他試劑均購自美國Sigma公司。

1.2PC12培養(yǎng)及低氧模型制備 PC12培養(yǎng)于含5%馬血清，5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃含有5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。隔天換液，待進(jìn)入對數(shù)生長期后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為未處理的對照組、低氧模型組、低、中、高劑量組(細(xì)胞用10、20、40 μmol/L Bellidifolin處理后低氧4 h，細(xì)胞放置在37℃孵育箱進(jìn)行低氧刺激)。低氧刺激條件：低氧(1%O2、5%CO2、94%N2)6 h和常氧(21%O2、5%CO2、74%N2)8 h。

1.3細(xì)胞活力檢測 取PC12，用DMEM培養(yǎng)液配成1×105/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，用不同濃度Bellidifolin(10、20、40 μmol/L)作用6 h后，低氧模型組和各給藥組給予低氧刺激，培養(yǎng)24 h后用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測細(xì)胞活性。測定570 nm處的吸光值，計算細(xì)胞存活率，每組設(shè)3個平行孔。

1.4Western印跡法檢測Caspase-3蛋白表達(dá) 每組細(xì)胞收集后加入RIPA裂解液，用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離裂解物(20 μg蛋白質(zhì))并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉4℃封閉，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，加入一抗孵育過夜，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G為第二抗體，室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，以β-Actin為內(nèi)參，放入暗盒壓片1 min后顯影，定影。通過凝膠成像系統(tǒng)，進(jìn)行蛋白表達(dá)量的半定量分析。

1.5免疫組織化學(xué)染色檢測MAPK信號通路兩種調(diào)控蛋白表達(dá) 取PC12爬片，按常規(guī)方法用4%多聚甲醛固定，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。免疫組化采用ENVISION二步法，正常山羊血清封閉，一抗4℃過夜(pERK抗體濃度為1∶200，p-p38MAPK抗體濃度為1∶500)。DAB顯色液顯色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。空白對照切片以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。應(yīng)用Image-pro plus5.0圖像分析系統(tǒng)對免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性細(xì)胞進(jìn)行OD值的測量。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1Bellidifolin對低氧PC12的影響 倒置熒光顯微鏡下見對照組PC12生長旺盛，多呈圓形或不規(guī)則形，胞核較大，胞體飽滿、偶有扁平而長的突起，貼壁好。低氧模型組細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，表現(xiàn)為細(xì)胞貼壁性差，胞體皺縮，見大量細(xì)胞碎片和漂浮死細(xì)胞；而用不同濃度Bellidifolin作用6 h后，再進(jìn)行低氧刺激，不同程度破壞了細(xì)胞形態(tài)，低劑量組破壞最嚴(yán)重，高劑量組細(xì)胞破壞最輕。見圖1。

圖1 5組細(xì)胞形態(tài)變化(×40)

2.2細(xì)胞存活率檢測 低氧模型組PC12存活率(42.07%±2.97%)明顯低于對照組(96.19%±2.41%，P<0.05)。與對照組相比，預(yù)先用不同濃度Bellidifolin作用6 h后，再進(jìn)行低氧刺激，PC12損傷減輕，細(xì)胞存活率明顯提高(P<0.05)，其中中、高劑量組細(xì)胞存活率(70.28%±4.00%，85.30%±2.45%)與低氧模型組、低劑量組(45.62%±4.83%)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3Bellidifolin對低氧誘導(dǎo)PC12 pERK蛋白表達(dá)的影響 PC12經(jīng)低氧處理后，pERK蛋白表達(dá)(OD值：7.31±0.65)略有降低，與對照組(7.74±0.41)及低、中、高劑量組(7.43±0.66、7.54±0.58，7.83±0.71)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4Bellidifolin對低氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞p-p38MAPK蛋白表達(dá)的影響 與對照組(OD值：4.66±0.49)比較，PC12經(jīng)低氧刺激6 h后，p-p38MAPK蛋白表達(dá)(7.46±0.52)顯著增強(qiáng)(P<0.05)。預(yù)先用不同濃度Bellidifolin作用6 h后，再進(jìn)行低氧刺激，PC12 p-p38MAPK蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，其中中、高劑量組p-p38MAPK蛋白表達(dá)(5.70±0.40、5.37±0.37)與低氧模型組、低劑量組(7.32±0.42)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 免疫組織化學(xué)檢測各組細(xì)胞p-p38MAPK表達(dá)(×100)

2.5Bellidifolin對低氧誘導(dǎo)PC12 MAPK信號通路下游產(chǎn)物Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 與對照組(1.00±0.06)比較，經(jīng)低氧刺激6 h后，可引起MAPK信號通路下游凋亡關(guān)鍵因子Caspase-3在PC12中的表達(dá)(2.96±0.34)顯著升高(P<0.05)。預(yù)先用不同濃度Bellidifolin作用6 h后，再進(jìn)行低氧刺激，PC12 Caspase-3表達(dá)顯著降低(P<0.05)，Caspase-3表達(dá)隨著Bellidifolin濃度的增大逐步降低(P<0.05)，低、中、高劑量組分別為1.96±0.46、1.49±0.37、0.99±0.20，見圖3。

圖3 Western印跡檢測各組細(xì)胞Caspase-3表達(dá)

3 討 論

缺血性腦血管疾病均可導(dǎo)致不同程度的腦神經(jīng)細(xì)胞缺血/缺氧。腦缺血/低氧損傷是引起中樞神經(jīng)元凋亡的起始因素，其與腦血管痙攣、腦動脈硬化、血栓形成和出血有關(guān)〔10，11〕。低氧對大腦的直接損傷是各種腦血管疾病的始動環(huán)節(jié)。MAPK在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制中，對神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞存活起到關(guān)鍵性作用，通過連續(xù)的磷酸化調(diào)節(jié)信號分子把外部環(huán)境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核及其他細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞生物功能關(guān)鍵細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路〔12〕。在缺血/低氧條件下，線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔打開，促凋亡蛋白釋放，并激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)來觸發(fā)細(xì)胞凋亡〔13〕。MAPK與缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷密切相關(guān)，低氧提高p-p38MAPK及MAPK信號傳導(dǎo)通路關(guān)鍵凋亡因子Caspase-3蛋白表達(dá)〔14〕。本研究證明低氧可導(dǎo)致PC12損傷，同時可降低細(xì)胞p38MAPK和Caspase-3蛋白表達(dá)。

細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化表明，Bellidifolin對PC12低氧模型發(fā)揮了有利作用。40 μmol/L Bellidifolin預(yù)處理，再低氧刺激后，PC12形態(tài)破壞明顯減輕，幾乎完整，細(xì)胞數(shù)量增加。Bellidifolin具有濃度依賴性，兩個較低濃度不能有效預(yù)防低氧導(dǎo)致的損傷。細(xì)胞存活率的數(shù)據(jù)再次證實(shí)，高濃度的Bellidifolin能夠提高細(xì)胞存活率。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，pERK通路不參與細(xì)胞低氧引起的細(xì)胞凋亡，但低氧引起p38MAPK蛋白質(zhì)表達(dá)顯著增加，p38MAPK通路參與細(xì)胞低氧引起的細(xì)胞凋亡，與Cui等〔14〕研究結(jié)果一致。說明Bellidifolin對抗低氧所致PC12損傷的能力與其降低p38MAPK和Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。Bellidifolin具有濃度依賴性，只有最高提取物量能有效恢復(fù)細(xì)胞活力、細(xì)胞形態(tài)和代謝控制水平。

綜上，Bellidifolin可有效抑制低氧所致的PC12凋亡，其機(jī)制可能與抑制p38MAPK信號通路的活化及下游Caspase-3的表達(dá)有關(guān)。