陶周善 周皖舒 江云云 吳興凈 張欣 楊民 謝加兵 徐祝軍

1. 皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，弋磯山醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，安徽 蕪湖 241000 2. 皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院老年病科，安徽 蕪湖 241000

人口老齡化是當(dāng)今世界一個(gè)突出性的社會(huì)問題，作為與其相關(guān)的疾病越來越引起世界的關(guān)注，骨質(zhì)疏松就是其中最常見的一種。由于骨吸收的增加或骨形成的減少，導(dǎo)致骨質(zhì)的連續(xù)損失和骨骼微結(jié)構(gòu)的退化，甚至是最小的創(chuàng)傷就會(huì)導(dǎo)致骨骼脆性骨折。隨著亞洲老齡人口的增加，該地區(qū)髖部骨折的發(fā)病率預(yù)計(jì)將從1990年到2050年增加到世界總量的1/4左右[1-2]，因此，預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥是一項(xiàng)嚴(yán)重的挑戰(zhàn)[3]。但目前對骨質(zhì)疏松癥的治療仍然不夠有效，研究骨質(zhì)疏松癥治療的組合治療的評估是必要的。骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)具有強(qiáng)大的誘導(dǎo)成骨能力，它能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖并向成骨細(xì)胞方向分化，大量的研究已證實(shí)骨形成蛋白具有安全有效誘導(dǎo)骨形成的功效[4]。雷奈酸鍶(strontium ranelate，SR)是目前臨床上所有抗骨質(zhì)疏松藥物中唯一一種兼具促進(jìn)成骨和抑制破骨的藥物，SR不僅可以通過促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化來促進(jìn)成骨，而且可以通過下調(diào)破骨細(xì)胞激活相關(guān)的一系列蛋白，從而起到抑制破骨的作用[5]。有研究表明SR通過內(nèi)源性BMP的上調(diào)表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[6]。受這些研究的啟發(fā)，筆者想進(jìn)一步探討是否通過外源性添加BMP來促進(jìn)SR的作用。本研究目標(biāo)是通過SR及BMP-2和成骨細(xì)胞的共培養(yǎng)來探討兩者聯(lián)合使用的可行性，為臨床上兩種藥物聯(lián)合使用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞來源

取出生24 h的SD大乳鼠作為原代成骨細(xì)胞來源，由皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM 培養(yǎng)基(GIBCO公司)，胎牛血清、胰蛋白酶(HyClone公司)；I 型膠原酶(Sigma公司)；噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、TritonX-100(Sigma公司)；SR(法國 Servier 公司)，BMP-2(Peprotech，美國)。

1.3 成骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)

大鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng)液使用DMEM，含有10%小牛血清，青霉素(100 U/mL)，鏈霉素(100 U/mL)，細(xì)胞培養(yǎng)在 37 ℃、含5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長覆蓋瓶底 80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.4 BMP-2 及SR共培養(yǎng)對成骨細(xì)胞的影響

1.4.1采用MTT法檢測成骨細(xì)胞增殖情況：實(shí)驗(yàn)分為4組：SR組、BMP-2組、SR-BMP組及對照組。用0.25%胰蛋白酶消化單層細(xì)胞，用含有10%FBS的DMEM 培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，共4列，培養(yǎng)24 h。在倒置顯微鏡下觀察，待大多數(shù)成骨細(xì)胞貼壁伸展后，棄去孔內(nèi)液體，用無血清的DMEM沖洗數(shù)次，加1% FBS的DMEM 200 μL。一列孔加入5 mmol/L的SR(SR組)，一列孔加入0.1 mg/L的BMP-2(BMP-2組)，一列孔同樣加入0.1 mg/L的BMP-2(SR-BMP組)，一列孔為對照組(對照組)，不加誘導(dǎo)液，3 d 換液1次，培養(yǎng)6 d換液后SR-BMP組的一列孔再次添加5 mmol/L的SR，繼續(xù)培養(yǎng)到12 d。加入10% MTT 溶液(5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞 2 h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，并加入DMSO(100 μL/孔)輕微震蕩，采用比色法通過酶標(biāo)儀檢測A 490 值。

1.4.2茜素紅染色及堿性磷酸酶活性測定：待上述成骨細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)12 d棄培養(yǎng)液，PBS漂洗2 遍，加入10% 福爾馬林固定10 min。棄固定液，0.1%茜素紅在37 ℃下染色5 min，流水沖洗，流水沖洗后換固定液，拍照記錄結(jié)果。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性采用 PNPP法測定，細(xì)胞培養(yǎng)12 d棄培養(yǎng)液，PBS漂洗2遍，1%Triton X-100反復(fù)凍融3次，細(xì)胞裂解物孵育在磷酸鹽底物中30 min，室溫37 ℃，然后加入1 mol/L的NaOH終止反應(yīng)，405 nm下測定吸光度值。根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化的Sigma 校正曲線，計(jì)算酶活性。

1.4.3成骨細(xì)胞骨鈣素(osteocalcin，OCN)及Runx2表達(dá)檢測：按上述方案培養(yǎng)到12 d，提取細(xì)胞總蛋白，加熱變性后，于-20 ℃保存。取蛋白30 μL，進(jìn)行 SDS-PAGE 凝膠電泳，將分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用封閉液封閉濾膜 4 h，依次結(jié)合相應(yīng)濃度的抗OCN抗體，抗Runx2抗體和抗GAPDH抗體(1∶1000)，于4 ℃孵育過夜，洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/兔抗鼠(1∶2000)，孵育1 h。用化學(xué)發(fā)光法曝光膠片，沖洗顯色，檢測相應(yīng)蛋白條帶。用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析蛋白條帶。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間細(xì)胞蛋白含量、ALP 定量及茜素紅定量結(jié)果采用單因素方差分析(ANOVA)，組間比較采用LSD-t法；P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 茜素紅染色及堿性磷酸酶活性

經(jīng)過BMP-2、SR以及BMP-2聯(lián)合SR的處理，各組細(xì)胞茜素紅染色及堿性磷酸酶染色的結(jié)果如圖1A、1B所示，定量結(jié)果如圖1C、1D所示，結(jié)果表明BMP-2、SR以及BMP-2聯(lián)合SR處理的成骨細(xì)胞的礦化能力及活性明顯增加，相對于對照組，實(shí)驗(yàn)組的成骨細(xì)胞礦化能力及ALP活性明顯增加，和對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且以BMP-2聯(lián)合SR處理細(xì)胞鈣化能力最強(qiáng)及ALP活性最高，這表明BMP-2聯(lián)合SR對成骨細(xì)胞礦化能力及活性影響明顯優(yōu)于單獨(dú)使用的效果。

2.2 共培養(yǎng)對成骨細(xì)胞增殖的影響

經(jīng)過BMP-2、SR以及BMP-2聯(lián)合SR的處理，MTT檢測的結(jié)果如圖1E所示，相對于對照組，實(shí)驗(yàn)組的成骨細(xì)胞數(shù)目明顯增加，和對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且以BMP-2聯(lián)合SR處理細(xì)胞數(shù)目最多，這表明BMP-2聯(lián)合SR對成骨細(xì)胞增殖影響明顯優(yōu)于單獨(dú)使用的效果。

2.3 成骨細(xì)胞OCN及Runx2的表達(dá)

經(jīng)過BMP-2、SR以及BMP-2聯(lián)合SR的處理，各組細(xì)胞OCN及Runx2蛋白表達(dá)的結(jié)果如圖1F所示，定量結(jié)果如圖1G、1H所示，結(jié)果表明BMP-2、SR以及BMP-2聯(lián)合SR處理的成骨細(xì)胞的OCN及Runx2蛋白表達(dá)明顯增加，相對于對照組，實(shí)驗(yàn)組的成骨細(xì)胞OCN及Runx2蛋白表達(dá)明顯增加，和對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且以BMP-2聯(lián)合SR處理細(xì)胞OCN及Runx2蛋白表達(dá)量最多，這表明BMP-2聯(lián)合SR對成骨細(xì)胞OCN及Runx2蛋白表達(dá)影響明顯優(yōu)于單獨(dú)使用的效果。

圖1 A：各組大鼠成骨細(xì)胞ALP染色結(jié)果；B：各組大鼠成骨細(xì)胞茜素紅染色結(jié)果；C：各組大鼠成骨細(xì)胞ALP活性定量結(jié)果；D：各組大鼠成骨細(xì)胞茜素紅染色定量結(jié)果；E：各組大鼠成骨細(xì)胞MTT定量結(jié)果；F：各組大鼠成骨細(xì)胞蛋白電泳結(jié)果；G：各組大鼠成骨細(xì)胞Runx2蛋白表達(dá)定量結(jié)果；H：各組大鼠成骨細(xì)胞OCN蛋白表達(dá)定量結(jié)果注：與對照組比較，*P<0.05；與SR組比較，#P<0.05；與BMP組比較，&P<0.05(CON：對照組，SR：SR組，BMP：BMP-2組，BMP-SR：SR-BMP組；×40)Fig.1 A: ALP staining results of rat osteoblasts in each group; B: Alizarin red staining results of rat osteoblasts in each group; C: ALP activity quantitative results of rat osteoblasts in each group; D: Alizarin red staining quantitative results of rat osteoblasts in each group; E: MTT quantitative results of rat osteoblasts in each group; F: Protein electrophoresis results of rat osteoblasts in each group; G: Runx2 protein expression quantitative results of rat osteoblasts in each group; H: OCN protein expression quantitative results of rat osteoblasts in each group.Note: Compared with the control group, *P<0.05; compared with the SR group, #P<0.05; compared with the BMP group, &P<0.05 (CON: control group, SR: SR group, BMP: BMP-2 group, BMP-SR: SR-BMP group; ×40)

3 討論

本研究通過SR聯(lián)合BMP-2使用來干預(yù)大鼠成骨細(xì)胞，觀察對成骨細(xì)胞增殖、鈣化能力及細(xì)胞活性和OCN及Runx2蛋白表達(dá)情況來研究聯(lián)合使用的可行性，通過藥物和成骨細(xì)胞共培養(yǎng)12 d，各組大鼠成骨細(xì)胞增殖情況、礦化能力及活性以O(shè)CN及Runx2蛋白表達(dá)情況被檢測；結(jié)果表明相對SR及BMP-2單獨(dú)使用的效果，聯(lián)合使用的效果更佳，能極大提高成骨細(xì)胞增殖能力，增加成骨細(xì)胞的功能如礦化，同時(shí)明顯增加OCN及Runx2蛋白的表達(dá)，這些結(jié)果表明SR聯(lián)合BMP-2來干預(yù)大鼠成骨細(xì)胞有一定潛力，為臨床上聯(lián)合使用治療骨質(zhì)疏松癥提供細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

骨骼在修復(fù)過程表現(xiàn)出一定的再生能力，以應(yīng)對在骨骼發(fā)育或整個(gè)成年人連續(xù)骨骼重塑過程中發(fā)生損傷。骨再生包括一系列良好骨組織誘導(dǎo)和傳導(dǎo)的生物過程，涉及許多細(xì)胞類型和細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外分子信號通路，通過確定的時(shí)間和空間序列，努力增強(qiáng)骨骼修復(fù)和恢復(fù)骨骼功能[7]。骨形成取決于不同方面的共同影響，如：特異性細(xì)胞類型間充質(zhì)干細(xì)胞和破骨細(xì)胞；骨基質(zhì)(羥磷灰石、鈣、細(xì)胞外基質(zhì)分子等)；可溶性分子(細(xì)胞因子、生長因子、激素、離子和維生素等)的表達(dá)和各種外界機(jī)械刺激[8-9]。信號分子可以分為3類：促炎細(xì)胞因子、TGF-β超家族和其他生長因子和血管生成因子[10-11]。白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)在啟動(dòng)修復(fù)級聯(lián)中起著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞因子也調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)骨形成和重塑。TNF-α促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的募集，在軟骨內(nèi)骨化時(shí)引起肥厚軟骨細(xì)胞凋亡，提供破骨細(xì)胞功能[12]。轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)超家族包括BMP、GDF，TGF促進(jìn)骨折愈合期間各個(gè)階段的內(nèi)膜和軟骨內(nèi)骨骨化。BMP是骨形成和愈合中最重要的生長因子[12]，BMP在骨髓間充質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的修復(fù)中產(chǎn)生，以觸發(fā)一系列事件，這些事件支持骨和軟骨的發(fā)育[13]。骨質(zhì)疏松癥出現(xiàn)骨小梁的微型骨折，骨質(zhì)疏松癥治療過程就是骨形成及骨折愈合的過程，BMP在此過程中發(fā)揮重要作用，局部添加BMP明顯可以增加去卵巢大鼠骨密度，增加骨強(qiáng)度。

近年來一種具有降低骨吸收和增加骨形成雙重作用機(jī)制的抗骨質(zhì)疏松藥SR被開發(fā)出來，它可治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，使椎體和髖部骨折的危險(xiǎn)性降低，使骨密度和強(qiáng)度得到增強(qiáng)，使其他藥物單向作用的弊端得到克服[14]。許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，SR可加快新骨的形成，同時(shí)減慢舊骨的重吸收。SR不僅可以抑制去勢大鼠骨質(zhì)的下降，還可以使正常動(dòng)物的骨質(zhì)得到增加，從而使骨質(zhì)的耐受能力增加[15]。同時(shí)它還可以在抑制破骨和刺激成骨的前提下增加骨質(zhì)，加快健康小鼠骨形成，提高脊椎骨的骨質(zhì)含量[16]。由于刺激骨形成和抑制骨吸收的顯著作用，鍶(Sr2+)已被并入生物材料/支架中，以改善骨再生應(yīng)用的生物活性[17-18]。據(jù)報(bào)道，Sr2+可能通過鈣敏感受體依賴機(jī)制或調(diào)節(jié)Wnt/b-連環(huán)蛋白，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，包括內(nèi)源性BMP-2的上調(diào)和MAPK通路[6，19]。本研究表明外源性添加BMP-2可以明顯增加SR的功能，對成骨細(xì)胞的增殖分化和功能都有明顯的促進(jìn)效果。

總的來說，雖然筆者沒有實(shí)驗(yàn)不同藥物劑量對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，但本實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)已經(jīng)達(dá)到，合適劑量的BMP-2和SR聯(lián)合使用對成骨細(xì)胞增殖、分化及功能有疊加作用，明顯優(yōu)于單獨(dú)使用的效果。