，，， ， ，

生長抑制基因家族((Inhibitor of Growth Family Member，ING)具有抑制腫瘤生長、改變細(xì)胞周期和引起細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能[1]。包括ING1，ING2，ING3，ING4和ING5五個成員，廣泛分布在各個組織中。ING各個成員編碼的蛋白不僅在結(jié)構(gòu)上有相似的特性，在功能上既有相似之處又各具特點[2-3]。其中，ING5定位于人染色體2p37.3上，能和p53和p300相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4]。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞中ING5 mRNA比正常的肝細(xì)胞低，表明正常肝細(xì)胞到癌變的肝細(xì)胞過程中ING5受到明顯的限制[5]。最近，Tang等人發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus ，HBV)能抑制ING 5的表達(dá)，過表達(dá)ING 5可抑制肝癌細(xì)胞的生長和誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[6]。

戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus， HEV)，是一種經(jīng)腸道傳播，嚴(yán)重危害人類健康的病毒性肝炎病原體。HEV感染后，一般患者多為輕中型肝炎，常為自限性，但可引發(fā)急性肝炎、爆發(fā)性肝衰竭，大多數(shù)人感染是無癥狀的自限型感染，致死率較低，通常情況下是1%～2%，而孕婦感染HEV致死率較高，達(dá)到20%～30%[7]。但是在免疫缺陷或者低下的患者，如：器官移植患者，獲得性免疫缺陷綜合征患者和白血病患者等[8]，可發(fā)展成慢性戊型肝炎。

目前HEV復(fù)制與ING5表達(dá)之間的關(guān)系尚未清楚，本實驗旨在構(gòu)建ING5真核表達(dá)載體和ING5熒光素酶載體，探究ING5與HEV之間的相互作用關(guān)系，為后期研究HEV復(fù)制對ING5的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞 大腸埃希菌DH5α感受態(tài)、真核表達(dá)載體PGC、pBSK(+)-ING5克隆載體、含HEV全基因組序列 (strain KM01， KJ155502)的載體PUC-HEV、肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞和人腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞均由昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院病毒感染與免疫課題組保存。

1.2主要試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑、DNA marker DL2000和DL5000購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA聚合酶和dNTP購自天根生化科技(北京)有限公司；Trizol和Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自北京莊盟生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；ING5多克隆抗體購自美國Proteintech公司；小鼠抗人的GAPDH多克隆抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠的IgG均購自美國KPL公司；氯仿和異丙醇等其他試劑均為分析純。

1.3引物設(shè)計及合成 根據(jù)GenBank中ING5(ID: 84289)基因序列，經(jīng)Oligo軟件分析設(shè)計引物，序列如下：上游5′-3′:GACTAGTCTTCATCCAAAACGATGATGC，下游：5′ -3′CAAGCTTGCGTTCCAAAAAATACTTTATT，擴增片段大小為723 bp；引物由上海捷瑞有限公司合成。

1.4ING5片段擴增 培養(yǎng)293T細(xì)胞，匯合度達(dá)到70% ～80%時，棄培養(yǎng)基，并用1×PBS洗滌細(xì)胞2次。利用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA。按照MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為：42 ℃ 60 min，72 ℃ 15 min。以5 μL cDNA為模板，PCR擴增ING5基因，條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 15 min。擴增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行片段回收。

1.5真核表達(dá)質(zhì)粒PGC-ING5的構(gòu)建 將PGC載體(見圖1)和ING5 PCR產(chǎn)物分別經(jīng)BamHΙ和HindIII雙酶切，膠回收載體和目的基因片段，以T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，用BamHΙ和HindIII雙酶切鑒定，并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序正確的質(zhì)粒命名為PGC-ING5。反應(yīng)體系如下：PGC載體骨架(200 ng)5 μL，目的片段(100 ng)12 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL，total 20 μL。

圖1 PGC載體圖譜Fig.1 PGC vector map

1.6293T細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)293T細(xì)胞。生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種至24孔板中，培養(yǎng)18～24 h，細(xì)胞達(dá)到80%～90%匯合度時，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒PGC-ING5，6 h后棄去上清，每孔中加入1 mL含2%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。同時設(shè)計轉(zhuǎn)染空載體PGC-ING5的細(xì)胞對照和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對照。

1.7Western blot檢測ING5蛋白的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，采用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，取10 μg總蛋白通過10%SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，將膜置于10%的脫脂奶中4 ℃封閉過夜，加入ING5(1∶1 000)一抗室溫孵育3 h。抗原抗體結(jié)合后以1×TPBS緩沖液漂洗3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶10 000)，室溫孵育l h，再以1×TPBS緩沖液漂洗5次，每次5 min，GAPDH(1∶5 000)作內(nèi)參對照。ECL顯影。

1.8ING5啟動序列的獲得 選取靶基因ING 5的3′UTR為啟動序列。分別取5 μg公司合成的pBSK(+)-ING5克隆載體，利用限制性內(nèi)切酶HindIII和SacI進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系如下：質(zhì)粒(5 μg),15 μL;HindIII, 2 μL;SacI,2 μL;Buffer,2.5 μL;ddH2O,3.5 μL;合計25 μL。

按照上述體系進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)條件為37 ℃，30 min，取酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定目的片段大小和位置，膠回收ING5啟動片段。

1.9pMIR-Report載體骨架的獲得 分別取1 μg pMIR-Report報告載體，其載體圖譜見圖2，利用限制性內(nèi)切酶SacI和HindIII對其進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系如下：pMIR-Report質(zhì)粒(1 μg)10 μL；HindIII，2 μL；SacI，2 μL；Buffer，2 μL；ddH2O，4 μL；合計20 μL。

按照上述體系進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)條件為37 ℃，30 min，取酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目的片段，作為重組載體的載體骨架。

圖2 PGC載體圖譜Fig.2 PGC vector map

1.10ING5熒光素酶載體構(gòu)建 取膠回收的pMIR-Report載體骨架片段和ING5 -3′UTR啟動片段，經(jīng)T4 DNA酶連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體，連接體系如下：pMIR-Report載體骨架(200 ng)5 μL；目的片段(100 ng)12 μL；T4 DNA Ligase，1 μL；10×T4 DNA Ligase Buffer，2 μL；合計20 μL。反應(yīng)條件為16 ℃過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。

1.11熒光素酶方法檢測 1)293T細(xì)胞鋪48孔板，24 h后轉(zhuǎn)染PUC-HEV 70 ng和pMIR-Report-ING5 70 ng。

2)24 h后，細(xì)胞用PBS細(xì)3次，加入PLB 65 μL每孔，置室溫?fù)u床15 min。

3)收集2)中裂解物置200 μL EP管中，12 000 g離心5 min。取上清。

4)取20 μL上清加入100 μL LARII，進(jìn)行Firefly luciferase activity檢測。

2 結(jié) 果

2.1ING5片段的擴增 通過RT-PCR體外擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，在723 bp左右出現(xiàn)特異性條帶，目的片段擴增成功，見圖3。

1: PCR擴增ING5目的片段；2: 空白對照；M: marker 2000。圖3 PCR擴增ING5目的基因片段Fig.3 PCR products of ING5

1: PGC-ING5質(zhì)粒雙酶(BanH I和Hind III)產(chǎn)物；2: 未酶切PGC-ING5質(zhì)粒；M: marker2000。圖4 真核表達(dá)質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物的鑒定Fig.4 Identification of PGC-ING eukaryotic expression vector

2.2真核表達(dá)質(zhì)粒PGC-ING5的鑒定 1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，真核表達(dá)質(zhì)粒PGC-ING5采用BamHΙ和HindIII雙酶切鑒定，可見723 bp的目的基因片段，大小與預(yù)期一致，見圖4。測序結(jié)果證明真核表達(dá)載體PGC-ING5構(gòu)建成功。

2.3ING5蛋白水平的檢測 文獻(xiàn)報道HepG2細(xì)胞中ING5低表達(dá)，而293T細(xì)胞中高表達(dá)。采用Western Blot法，發(fā)現(xiàn)293T細(xì)胞中ING5高表達(dá)，在HepG2未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載組ING5低表達(dá)，而在轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體PGC-ING5的實驗組中成功過表達(dá)ING5。并且通過灰度分析，再次證明真核表達(dá)質(zhì)粒PGC-ING5在HepG2細(xì)胞中成功表達(dá)，見圖5和圖6。

圖5 Western blot 檢測ING5表達(dá)情況Fig.5 Determination of ING5 expression by Western blot

圖6 灰度分析ING5的表達(dá)情況Fig.6 Analysis of ING5 expression using image J software

2.4ING5熒光素酶載體的鑒定 1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，pMIR-Report-ING5熒光素酶質(zhì)粒采用SacI和HindIII雙酶切鑒定，可見218 bp的目的片段，大小與預(yù)期一致，見圖7。測序結(jié)果證明pMIR-Report-ING5熒光素酶載體構(gòu)建成功。

1: 未酶切PGC-ING5質(zhì)粒；2: pMIR-Report-ING5質(zhì)粒雙酶(SacI和HindIII)產(chǎn)物；M: marker2000。圖7 pMIR-Report-ING5質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物的鑒定Fig.7 Identification of pMIR-Report-ING5 vector

圖8 細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性的變化Fig.8 The detection of luciferase activity

2.5ING5與HEV相互作用 為了進(jìn)一步探究HEV與ING5之間的相互作用關(guān)系，我們將pMIR-Report- ING5熒光素酶質(zhì)粒及PUC-HEV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染239T細(xì)胞24 h后，對各組中熒光素酶活性進(jìn)行檢測。通過比較pMIR-Report-ING5轉(zhuǎn)染組、空白對照組和PUC-HEV 與pMIR-Report-ING5共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性。結(jié)果顯示，PUC-HEV 和pMIR- Report-ING5共轉(zhuǎn)染組與pMIR-Report-ING5轉(zhuǎn)染組相比，細(xì)胞中熒光素酶活性降低93.4%(見圖8)，表明 HEV明顯抑制293T細(xì)胞中pMIR-Report-ING5熒光素酶的表達(dá)。證明 HEV與ING5之間具有直接相互作用。

3 討 論

近年來，ING家族與癌癥的發(fā)生和發(fā)展之間的關(guān)系引起人們的高度關(guān)注。已有研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中ING1，ING2，ING4和ING5的mRNA表達(dá)均下調(diào)[9-11]。ING5是生長抑制基因家族主要的一員，在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)是至關(guān)重要的。ING5編碼的腫瘤抑制蛋白，能抑制細(xì)胞生長并誘導(dǎo)凋亡。ING5在轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中能與腫瘤抑制基因相互作用[12]。

戊型肝炎在亞洲和非洲國家不斷暴發(fā)流行，已經(jīng)成為嚴(yán)重的全球性公共健康問題。2012年根據(jù)WHO報道，僅亞洲和非洲地區(qū)就有近2010萬人感染HEV，其中7萬人死于HEV感染所引發(fā)的重癥肝炎，東亞和南亞已經(jīng)成為HEV感染的重災(zāi)區(qū)，感染率占全球的60.6%，死亡率占全球的64.7%[13]。2014年發(fā)布的全國第三屆病毒性肝炎調(diào)查報告顯示：中國是戊肝的高發(fā)國家，HEV在全國不同省份的流行情況有較大差異，四川、貴州、成都、新疆、云南等成了新的HEV高發(fā)地區(qū)[14]。近年，我國戊肝的發(fā)病率一直呈持續(xù)上升的趨勢。但是人們對HEV的復(fù)制機制和它與宿主的關(guān)系尚未清楚。

為進(jìn)一步研究宿主基因ING5 與HEV之間關(guān)系，本文利用了熒光素酶作為載體，成功構(gòu)建了pMIR-REPORT/ING5熒光素酶重組報告載體。利用熒光酶標(biāo)儀對反應(yīng)體系中(含有熒光素酶的細(xì)胞裂解液與反應(yīng)所需的試劑混合體系)迅速衰減的黃綠色閃光(發(fā)射峰560 nm)進(jìn)行檢測。當(dāng)?shù)孜镞^量時，發(fā)光量的總值與樣品的熒光酶活性成正比，因此，可對熒光素酶報告基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行間接評估。熒光素酶報告系統(tǒng)為啟動子及其上游基因活性的檢測提供了一個靈敏、快速和安全的非放射性的檢測方法。本文研究發(fā)現(xiàn)HEV明顯抑制293T細(xì)胞中pMIR-Report-ING5的熒光素酶活性，說明HEV可能通過抑制 ING5為自身感染和復(fù)制提供有利條件。

綜上所述， 本文初步研究發(fā)現(xiàn)HEV顯著抑制ING5熒光素酶的活性，為下一步研究HEV復(fù)制機制提供實驗基礎(chǔ)，進(jìn)而了解HEV與宿主細(xì)胞的相互作用關(guān)系提供了新的思路。