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類鼻疽病(Melioidosis)是一種流行于熱帶、亞熱帶地區(qū)的自然疫源性傳染病,可引起敗血癥、肺炎等嚴(yán)重臨床表現(xiàn)，死亡率高達(dá)20%～40%[1]。此病的致病菌-類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderiapseudomallei, 簡(jiǎn)稱類鼻疽伯克菌)是一種革蘭氏陰性腐生菌，棲息于熱帶地區(qū)的土壤、水體中，主要通過皮膚接觸、氣溶膠吸入、消化道等途徑感染人和動(dòng)物。類鼻疽的感染、發(fā)病通常受氣候、宿主免疫狀態(tài)、職業(yè)暴露機(jī)會(huì)等因素影響，但環(huán)境中是否存在類鼻疽伯克菌是判定類鼻疽疫源地的決定因素[1]。在東南亞、澳大利亞北部等世界主要類鼻疽流行區(qū)，高發(fā)病率與環(huán)境中類鼻疽伯克菌的高分離率呈正相關(guān)[2]。

海南省于1990年首次發(fā)現(xiàn)人類鼻疽病例[3]，目前已成為我國類鼻疽病危害最為嚴(yán)重的地區(qū)之一。然而，目前對(duì)該地區(qū)類鼻疽流行病學(xué)，尤其病原菌的生態(tài)、地理分布特征，傳播方式，感染途徑等尚不明確，嚴(yán)重影響了防控工作的開展。以往曾有自海南外環(huán)境分離出類鼻疽伯克菌及其近緣相似菌-泰國伯克霍爾德菌的報(bào)道[4]。但以上研究中環(huán)境類鼻疽伯克菌的低分離率與當(dāng)前海南類鼻疽的流行態(tài)勢(shì)不能吻合，提示可能存在尚未了解的流行影響因素。此外，在海南地區(qū)，盡管已經(jīng)證實(shí)外環(huán)境中存在類鼻疽伯克菌，但環(huán)境菌株與致病菌株間的關(guān)聯(lián)尚未被證實(shí)過，這需要菌株間的遺傳信息比對(duì)提供直接證據(jù)。

為深入了解海南地區(qū)類鼻疽病的流行原因，我們對(duì)海南一例類鼻疽患者的居住環(huán)境進(jìn)行了病原學(xué)調(diào)查；通過基于分子分型技術(shù)的菌株同源性比對(duì)，進(jìn)一步明確了感染來源，為類鼻疽疫情的科學(xué)防控提供了重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1病史 患者為男性，海南省三亞市某農(nóng)場(chǎng)農(nóng)民，于2014年6月因高熱、泌尿道感染入院治療。病人患糖尿病多年。病原學(xué)檢查：采集患者尿道分泌物、靜脈血；前者直接接種血平板，后者經(jīng)血培養(yǎng)培養(yǎng)物接種血平板；分離出類鼻疽伯克菌各1株，分別命名為HN186，HN187(表2)。臨床診斷：糖尿病合并類鼻疽性敗血癥；類鼻疽性泌尿系感染；膿毒血癥。病人經(jīng)美羅培南聯(lián)合左氧氟沙星抗感染治療，病愈出院。

1.2環(huán)境樣品采集與菌株分離 病人住院期間，經(jīng)患者及家屬同意，參照“國際類鼻疽工作組”推薦的類鼻疽伯克菌環(huán)境采樣策略及分離方案[5]，采集患者居住地周圍的泥土、稻田水、井水等環(huán)境樣品共58份(29個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)采樣2份，采樣量每份約50 g，見表1)，立即送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌株分離。簡(jiǎn)述如下：1)取10 g樣品，加入Ashdown液體培養(yǎng)基20 mL，震蕩培養(yǎng)24 h(42 ℃)；2)吸取培養(yǎng)物100 μL，涂布于Ashdown選擇性平板，37 ℃孵育，至48 h后每日觀察菌落形態(tài)特征；3)挑取粉紅或淺紫色、扁平、周邊皺褶，有金屬光澤的類鼻疽伯克菌疑似菌落，接種于Ashdown選擇性平板用于進(jìn)一步鑒定。

1.3 細(xì)菌學(xué)鑒定

1.3.1使用類鼻疽抗原檢測(cè)膠體金試劑進(jìn)行血清學(xué)鑒定，讀取結(jié)果并記錄。

1.3.2參照文獻(xiàn)[4]，通過16S rDNA基因序列，三型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion system，TTSS1)、伯克霍爾德菌致死因子(BurkholderiaLethal Factor 1，BLF1)等類鼻疽伯克菌特異毒力因子的攜帶情況對(duì)疑似菌株進(jìn)行鑒定。

1.3.3PCR檢測(cè)泰國伯克菌樣鞭毛基因簇(BurkholderiaThailandensis-like flagellar gene cluster, BTFC)/ 耶爾森菌樣菌毛基因簇(Yersinia-like fimbrial gene cluster, YLF)攜帶情況[6]。BTFC引物：Btfc_orf18_forward(5′-GTC GAT TTC GGC TGC GAA ACA ACA-3′)，Btfc_orf18_reverse(5′-ATG CCG TCG CAA CCA TTG ATG ATG-3′)；YLF引物：BPSS0120_forward(5′-TGA CCC ATT CAG GCA AGG GAT TCT-3′)，BPSS0120_reverse(5′-TCC GTC CTG TTC GGT GAT TTC GAT-3′)。PCR 反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件同上。

1.4 分子分型及同源性分析

1.4.1多位點(diǎn)序列分型(MLST) 參照文獻(xiàn)[7]，收集菌株培養(yǎng)物并提取染色體DNA，然后進(jìn)行ace、gltB、gmhD、lepA、lipA、narK、ndh等7個(gè)等位基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序。測(cè)序結(jié)果校對(duì)后提交類鼻疽伯克菌MLST 數(shù)據(jù)庫(http：//bpseudomallei.mlst.net)，獲得等位基因序列號(hào)并確定菌株序列型(ST)。

1.4.2脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE) 實(shí)驗(yàn)步驟及電泳參數(shù)與以往文獻(xiàn)相同[8]，采用BioNumerics 5.0軟件(比利時(shí)Applied Maths公司)進(jìn)行同源比對(duì)及聚類分析。

1.4.3多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA) 參照Bart等建立的類鼻疽伯克菌MLVA_4分型方案[9]，提取菌株染色體DNA，然后進(jìn)行4個(gè)VNTR位點(diǎn)(2341,1788,933,389)的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物送北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳，根據(jù)GeneScan 500 LIZ DNA Marker(美國ABI公司)確定擴(kuò)增產(chǎn)物長度。根據(jù)產(chǎn)物長度計(jì)算各VNTR位點(diǎn)的重復(fù)次數(shù)，并獲得MLVA_4指紋譜。

2 結(jié) 果

2.1環(huán)境樣品種類及菌株分離結(jié)果 采集的環(huán)境樣品分為4種類型：患者居住地周圍泥土、患者家芒果園泥土、患者家稻田泥土、患者及鄰居家水井水；29個(gè)采樣點(diǎn)的類型分布見表1。58份環(huán)境樣品中共分離出3株類鼻疽伯克菌的疑似菌：HN85e、HN86e、HN161e，均來源于水井水(表1)。其中，HN85e、HN86e自類鼻疽患者家水井水分離，HN161e自鄰居家水井水分離，兩井相距約80 m。

表1 環(huán)境樣品類型、分布及類鼻疽伯克菌分離培養(yǎng)結(jié)果
Tab.1 Types and distribution of environmental samples, results of isolation and culture of Burkholderia pseudomallei

環(huán)境樣品種類采集樣品數(shù)量疑似菌株數(shù)量所占百分比(%)患者居住地周圍泥土1600患者家芒果園泥土800患者家稻田泥土3000患者及鄰居家水井水4375共計(jì)5835

2.2 分離菌株細(xì)菌學(xué)鑒定結(jié)果

2.2.1類鼻疽抗原血清學(xué)鑒定結(jié)果 HN186、HN187、HN85e、HN86e、HN161e均為陽性。

2.2.216S rDNA序列分析 經(jīng)測(cè)序比對(duì)，病人分離株(HN186、HN187)、環(huán)境分離株(HN85e、HN86e、HN161e)的16S rDNA序列與類鼻疽伯克菌測(cè)序株K96243的16S rDNA序列同源性為100%。

2.2.3毒力基因攜帶情況 經(jīng)檢測(cè)，病人分離株(HN186、HN187)、環(huán)境分離株(HN85e、HN86e、HN161e)均攜帶TTSS1及BLF1相關(guān)基因(表2)。

2.2.4BTFC/YLF基因簇是重要的類鼻疽種群(澳大利亞/東南亞)指示標(biāo)簽[6]，并且可用于類鼻疽伯克菌分子診斷。通過PCR檢測(cè)，HN186、HN187、HN85e、HN86e、HN161e均為BTFC陰性，YLF陽性，符合東南亞群類鼻疽伯克菌特征(表2)。

表2 病人臨床分離株、環(huán)境分離株來源及特異診斷基因攜帶情況
Tab.2 Sources of clinical isolates, environmental isolates and carrying status of specific diagnostic genes

菌株名稱來源TTSS1BLF1BTFCYLFHN186患者血液++-+HN187尿道分泌物++-+HN85e患者家井水++-+HN86e患者家井水++-+HN161e患者鄰居家井水++-+

2.3 分子分型及同源性比對(duì)結(jié)果

2.3.1MLST分型 病人分離株HN186、HN187的ST型別相同，均為ST677(指紋譜：1,1,3,1,1,22,1)。環(huán)境分離株中，HN85e(ST677)與病人菌株ST型相同；HN86e(ST1394，指紋譜：1,1,6,1,1,29,3)、HN161e(ST376，指紋譜：1,4,2,3,8,4,3)與病人分離株分別在3個(gè)和6個(gè)等位基因存在差異。

2.3.2PFGE分型 病人分離株HN186與3株環(huán)境分離株的帶型比對(duì)見圖1。HN186與環(huán)境菌株HN85e帶型相似度為100%；與HN86e、HN161e差異較大，帶型相似度分別為82%、76%。

2.3.3MLVA_4指紋譜 病人分離株HN186、HN187的MLVA_4指紋譜與環(huán)境菌株HN85e相同(5,4,8,2)；與其余兩株環(huán)境菌株HN86e、HN161e完全不同(圖1)。

圖1 病人分離株HN186與3株環(huán)境菌株的PFGE比對(duì)圖Fig.1 Comparison of PFGE between HN186 isolated from patients and 3 strains of environmental strains

3 討 論

溯源調(diào)查是傳染病疫情處理過程中的重要環(huán)節(jié)，對(duì)于明確病原體來源，判斷感染原因，制訂防控措施意義重大。近年來，海南地區(qū)類鼻疽流行呈上升趨勢(shì)，但是相關(guān)病例的感染源調(diào)查工作開展較少，對(duì)病原來源、感染方式的認(rèn)知往往基于經(jīng)驗(yàn)或者國外文獻(xiàn)報(bào)道，缺乏實(shí)證，已經(jīng)不能滿足類鼻疽防控工作的要求。本次調(diào)查通過環(huán)境樣品采集、菌株分離鑒定、分子特征比對(duì)等工作，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了一例類鼻疽病人的臨床分離菌株與其自家水井水分離菌株同源，因此水井水很可能是引起類鼻疽病的感染源。以往海南類鼻疽流行病學(xué)報(bào)道中，農(nóng)民占較大比例，因此推測(cè)職業(yè)暴露尤其水稻種植是海南類鼻疽病感染的重要原因[10]。本調(diào)查在病人家稻田、芒果園樣品中未分離出類鼻疽伯克菌，但在居住地水井中分離到三株類鼻疽伯克菌，提示社區(qū)環(huán)境污染導(dǎo)致的類鼻疽感染應(yīng)引起關(guān)注。與職業(yè)暴露相比，生活用水由于接觸機(jī)會(huì)多，感染途徑(皮膚接觸、氣溶膠、消化道等)多，因此引發(fā)類鼻疽病的危險(xiǎn)性更大，可能引發(fā)更加嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。2011年及2012年，澳洲北部、泰國東北部均有生活用水污染引起類鼻疽流行的報(bào)道[11-12]。針對(duì)這一情況，衛(wèi)生部門應(yīng)加強(qiáng)水井等供水設(shè)施的衛(wèi)生檢測(cè)、衛(wèi)生清理工作，保證水源安全；同時(shí)廣泛開展類鼻疽病相關(guān)宣教工作，提高居民尤其糖尿病等易感人群對(duì)類鼻疽病及其防護(hù)措施的認(rèn)知度。

分子分型技術(shù)在類鼻疽病疫情調(diào)查及溯源中已有成功應(yīng)用。Mark等通過比較澳大利亞達(dá)爾文地區(qū)類鼻疽環(huán)境分離株、臨床分離株的ST型別譜，發(fā)現(xiàn)部分臨床菌株與井水分離株ST型相同，推測(cè)水井可能是重要類鼻疽感染源[12]。Bart等比較了澳洲北部一起類鼻疽暴發(fā)流行臨床分離菌株的PFGE指紋譜，確認(rèn)所有菌株為同一來源，并且與當(dāng)?shù)毓┧到y(tǒng)中類鼻疽分離菌株同源[13]。然而，類鼻疽伯克菌基因組學(xué)研究表明，受重組、回復(fù)突變、分辨能力等影響，僅依靠MLST或者PFGE的一致性，不能充分證明菌株相關(guān)性[14]。本次研究，我們引入了更加靈敏的MLVA-4分型方案。以上3種遺傳標(biāo)志，從不同方面證實(shí)外環(huán)境菌株與臨床菌株間的遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)，可靠性更高。

此次調(diào)查，明確了患者的感染來源，并為證明海南地區(qū)是類鼻疽的自然疫源地提供了實(shí)例。然而，相關(guān)病例感染途徑、居民區(qū)水井被類鼻疽伯克菌污染的程度及原因等仍不確定，今后需進(jìn)行更加廣泛的流行病學(xué)調(diào)查工作。