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囊型包蟲(chóng)病(echinococcosis)又稱(chēng)細(xì)粒棘球蚴病(cystic echinococcosis， CE)，是由細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(Echinococcosisgranulosus，Eg)的幼蟲(chóng)階段寄生于人體或者宿主動(dòng)物而引起的疾病，在我國(guó)主要存在于新疆、青海等畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的省區(qū)，已成為嚴(yán)重的公共問(wèn)題[1]。細(xì)粒棘球蚴病主要影響肝臟和肺臟，發(fā)生率分別為50%～70%和20%～30%[2]。肝囊性包蟲(chóng)病治療主要以手術(shù)為主[3]，但是，肝囊性棘球蚴病患者手術(shù)過(guò)程中，如果存在頭節(jié)外漏或殘腔殘留，則會(huì)導(dǎo)致術(shù)后棘球蚴病的復(fù)發(fā)，因此亟需發(fā)現(xiàn)一種既能滅殺細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)又對(duì)機(jī)體和周?chē)】蹈谓M織損傷較小的藥物。

近年來(lái)，許多研究發(fā)現(xiàn)，膽汁酸作用于腫瘤細(xì)胞后可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的活力，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，濃度升高，抑制效果越明顯[4-5]。本研究通過(guò)觀察不同濃度甘氨鵝脫氧膽酸(glycochenodeoxycholic acid， GCDCA)對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的活力及 ROS水平變化，希望為囊性棘球蚴病的治療提供一個(gè)新的研究方向。

1 材料與方法

1.1材料 含細(xì)粒棘球蚴囊泡的羊肝買(mǎi)自新疆昌吉市屠宰場(chǎng)。甘氨鵝脫氧膽酸與caspase-3檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于美國(guó) sigma 公司；ROS 檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成公司；RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自上海哈靈生物公司，胎牛血清購(gòu)自四季青生物有限公司。

1.2原頭節(jié)的體外培養(yǎng) 獲取含細(xì)粒棘球蚴病囊泡的羊肝，用雙蒸水及75%酒精分別清洗沖洗肝臟囊泡表面，在無(wú)菌條件下抽取含原頭節(jié)的囊液置于培養(yǎng)瓶中，靜置，抽掉上清，用 PBS(PH7.2)液洗滌4～6遍，用0.1%伊紅染液做染色排斥實(shí)驗(yàn)，98%以上拒染時(shí)可用于實(shí)驗(yàn)。將原頭節(jié)移至含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基(青霉素及鏈霉素各100 U/ mL)的培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3GCDCA作用于細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié) 將原頭節(jié)分為空白對(duì)照組及500、1 500、2 500 μmol/L GCDCA 組。于無(wú)菌條件下用PBS 清洗體外培養(yǎng)后的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)至其活力≥98%；取六孔板，按照設(shè)置好的體系及分組加入相應(yīng)培養(yǎng)基，每組培養(yǎng)基中加入約2 500個(gè)原頭節(jié)，放于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，從加藥24 h開(kāi)始，每天抽取100 μL培養(yǎng)液，用0.1%伊紅染色法檢測(cè)原頭節(jié)活力并在倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。無(wú)活力或者活力差的原頭節(jié)會(huì)被染成紅色；活力較好的頭節(jié)不被染色，且可活動(dòng)。間隔3 d更換培養(yǎng)液，重新加藥。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4caspase-3的酶活力測(cè)定 取空白組及500、1500、2500 μmol/ L GCDCA組作用24 h后的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)，PBS清洗3次后。每3 mg原頭節(jié)中加入120 μL裂解液，超聲破碎(功率、時(shí)間、次數(shù))，4 ℃ 12 000 g高速離心10 min后，抽取上清液。按照caspase-3檢測(cè)試劑盒步驟將反應(yīng)體系加入96孔板中，于37 ℃避光孵育，待顏色變化較明顯時(shí)，用 Bio- RAD酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(A405值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5ROS水平的測(cè)定 收集空白組及500、1500、2500 μmol/L GCDCA 組作用24h 后的原頭節(jié)，更換含DCFH-DA 10μmol/L 無(wú)血清培養(yǎng)基，37 ℃避光孵育1 h，棄培養(yǎng)液，PBS 清洗3次，靜置，待自然沉淀后收集原頭節(jié)，用Bio-RAD 熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)DCFH OD 值，488nm 激發(fā)波長(zhǎng)，525nm 發(fā)射波。然后用PBS清洗3次，并在熒光顯微鏡下觀察原頭節(jié)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA) 和最小顯著差法(LSD)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1GCDCA作用原頭節(jié)后活力的變化 GCDCA作用后的原頭節(jié)活力曲線見(jiàn)圖1。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，同一藥物濃度下原頭節(jié)存活率逐漸降低；在同一時(shí)間下，隨著藥物濃度的增加，原頭節(jié)存活率也降低。由此可推測(cè)GCDCA誘導(dǎo)原頭節(jié)死亡具有時(shí)間和濃度依賴(lài)性。

圖1 不同濃度GCDCA作用原頭節(jié)后活力值Fig.1 Inhibitory effects of GCDCA on in vitro E. granulosus protoscoleces

2.2GCDCA作用后原頭節(jié)體內(nèi)caspase-3 酶活性的變化 體外培養(yǎng)24 h 后的各組原頭節(jié)分別進(jìn)行caspase-3酶活性檢測(cè)，結(jié)果如圖2。在同一時(shí)間內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，caspase-3活性逐漸增強(qiáng)，GCDCA作用組同空白組比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)caspase-3活性檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=555.162，P<0.05)，以2 500 μ mol/ L GCDCA濃度組 caspase-3酶活性增加更顯著。

注：* 與空白對(duì)照組比較，P<0.05。圖2 GCDCA 作用24 h 后原頭節(jié)caspase-3 酶活性變化Fig.2 Activity of caspase-3 in E. granulosus protoscoleces incubated with GCDCA for 24 h

2.3GCDCA作用后原頭節(jié)內(nèi)ROS 水平的變化 DCFH-DA 熒光染色后，GCDCA組原頭節(jié)可見(jiàn)綠色熒光，ROS 的熒光強(qiáng)度隨GCDCA濃度增加而增強(qiáng)見(jiàn)圖3(A、B、C、D)，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)顯示終濃度 500、1500、2500 μmol/LGCDCA 作用后 ROS 熒光強(qiáng)度分別為對(duì)照組 2.53、3.71、5.25 倍(F=216.901,P<0．05)，見(jiàn)圖3E。

注：* 與空白對(duì)照組比較，P<0.05。A:空白對(duì)照組(×100), B:500 μM GCDCA 處理組 (×100), C: 1500 μM GCDCA 處理組 (×100), C: 2500 μM GCDCA 處理組 (×100), E: ROS 熒光強(qiáng)度。圖3 GCDCA 作用24 h 后原頭節(jié)ROS水平變化Fig.3 Impact of GCDCA on ROS level in E. granulosus protoscoleces after 24 h post-incubation

3 討 論

囊性棘球蚴病可發(fā)病于機(jī)體的多個(gè)部位，肝臟是主要受累器官[2]。阿苯達(dá)唑是目前國(guó)際上公認(rèn)的滅殺原頭節(jié)的藥物[6]，但臨床上應(yīng)用效果并不理想，長(zhǎng)期口服阿苯達(dá)唑會(huì)引起如肝損傷及胃腸道功能紊亂等不良反應(yīng)[7]。因此，尋找一種安全、有效的滅殺原頭節(jié)的新型藥物對(duì)于治療及預(yù)防肝包蟲(chóng)病術(shù)后復(fù)發(fā)具有重要的意義。

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，膽汁酸可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌、前列腺癌等細(xì)胞凋亡[8-9]。膽汁酸具有的細(xì)胞毒性能破壞細(xì)胞質(zhì)膜，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi) ROS的產(chǎn)生，而 ROS可進(jìn)一步增強(qiáng)膽汁酸的細(xì)胞毒性作用， 最終誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[10]。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，GCDCA 具有細(xì)胞毒性，能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[11-12]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GCDCA 能抑制體外細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的存活，且隨著藥物濃度的增加，原頭節(jié)的死亡率呈增高趨勢(shì)。原頭節(jié)的活力曲線顯示2500 μmol/L GCDCA對(duì)原頭節(jié)的抑制作用顯著強(qiáng)于其他低濃度組(500、1500μmol/L GCDCA)。此外1500 μmol/L GCDCA 作用1 d 時(shí)原頭節(jié)的存活率為61%，作用3 d 時(shí)其存活率下降到40%。提示GCDCA具有潛在的抗肝囊性包蟲(chóng)病作用。

在不同的病理過(guò)程中，由于許多的分子信號(hào)通路均可調(diào)節(jié)caspase-3，故caspase-3通常被當(dāng)做凋亡的關(guān)鍵蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，GCDCA作用24 h 后caspase-3酶活性開(kāi)始增加，2500 μmol/L GCDCA 增加最明顯。該結(jié)果說(shuō)明GCDCA能夠明顯誘導(dǎo)caspase-3的表達(dá)增加，這與史紅娟等[13]的研究結(jié)果具有一致性。

許多病理過(guò)程發(fā)現(xiàn)有活性氧(ROS)的參與[14]。有關(guān)研究表明[15]，在體外研究條件下，過(guò)量的ROS 能夠?qū)е戮€粒體結(jié)構(gòu)受損，產(chǎn)生凋亡誘導(dǎo)因子，從而激活下游的caspase途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在本研究中，我們觀察到細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)早期就能夠產(chǎn)生ROS。在用 GCDCA處理后24 h后，我們觀察到細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)內(nèi) ROS明顯增加，并且隨著 GCDCA濃度的增加，原頭節(jié)內(nèi) ROS的水平也明顯的升高。原頭節(jié)內(nèi)ROS的產(chǎn)生和增加程度同casapse-3的激活和升高趨勢(shì)是一致的。

目前，許多研究證實(shí) ROS與腫瘤細(xì)胞凋亡之間存在聯(lián)系，細(xì)胞內(nèi) ROS水平的變化可引起凋亡相關(guān)信號(hào)通路發(fā)生變化，最終激活 caspase-3；ROS 產(chǎn)生先于caspase-3的活化，提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[16-17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn) GCDCA能明顯提高原頭節(jié)內(nèi) ROS水平，這提示 ROS可能參與 GCDCA誘導(dǎo)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)凋亡過(guò)程，但進(jìn)一步相關(guān)作用途徑有待進(jìn)一步研究。