曹金秀 江雁瓊 孫嘉

廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院（廣州510700）

肺癌在最近幾十年里逐漸成為全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，伴隨醫(yī)學技術的不斷發(fā)展，肺癌診斷和治療已取得了很大的進步，但是患者的5年生存率仍然很低。大量的研究表明［1］，肺癌發(fā)病是一個多基因參與、多步驟的復雜病變過程，先是產生組織學上可以辨認的癌前病變，最后導致侵襲性腫瘤產生。肺癌的危險因素包括接觸到的環(huán)境或職業(yè)致癌物，如汽車尾氣、芳香化合物、石棉、砷、吸入的放射性物質等。盡管越來越多的肺癌危險因素已經被明確，但是其發(fā)生發(fā)展的機制仍不清楚。隨著非編碼RNA研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)其在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有十分重要的作用。環(huán)狀RNA（circular RNA，cir?cRNA）是一類新興的非編碼RNA分子，與傳統(tǒng)的線性RNA不同，circRNA的分子結構呈封閉環(huán)狀，不含有5′和3′末端，不易被核酸內切酶降解，具有一定的組織特異性。目前，對于circRNA作為肺癌標志物的研究報道較少。研究報道［2］hsa_cir?cRNA_100855為鼻咽癌circRNA芯片中顯著高表達的基因，且hsa_circRNA_100855可作為鼻咽癌新的非編碼RNA標志物。經GEO數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）及circBase數據庫（http：//www.circbase.org/）的 查 找 及 分 析 可 知 ，hsa_cir?cRNA_100855與 has_circ_0023033為同一個cir?cRNA，簡稱circ0023033。本研究主要尋找鼻咽癌新的circRNA標志物在同為呼吸系統(tǒng)腫瘤肺癌中的表達，探究其是否具備作為肺癌診斷標志物的潛力。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與細胞

1.1.1 主要儀器 超凈工作臺（1300 Series A2，Thermo Scientific），CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo Scien?tific），-80℃超低溫冰箱（Thermo Scientific），液氮罐（Thermo Scientific），電熱恒溫水浴箱（蘇州長風），制冰機（SM?F123 SANYO），倒置顯微鏡（Nikon），冰箱（Haier，Samsung），AB?7500實時PCR儀（Applied Biosystems），BG?thermo RT恒溫儀（BAYgene）ND?1000紫外/可見分光光度計（Nano?drop Tecnologies）。

1.1.2 主要試劑 MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、RPMI?1640培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO、胰蛋白酶、青?鏈霉素雙抗（Gibco），TRIzol裂解液（Invitro?gen），GoScript Reverse Transcription System、GoTaq qRCR Master Mix（Promega），microRNA 試 劑 盒（GeneCopoeia）。

1.1.3 細胞系 人永生化支氣管黏膜上皮細胞（BEAS?2B），人肺癌細胞（H661、H1299、SK?MES?1）來自廣州伯信生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) BEAS?2B細胞使用含10%胎牛血清和1%青?鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，H661和H1299細胞使用含10%胎牛血清和1%青?鏈霉素雙抗的 RPMI?1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，SK?MES?1細胞使用含10%胎牛血清和1%青?鏈霉素雙抗的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)。當細胞融合度達到80%左右時，使用胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 常規(guī)細胞RNA提取 收集細胞后使用TRIzol進行裂解后，按照試劑盒說明書提取總RNA，而后使用Nanodrop?1000紫外/可見分光光度計測定RNA濃度，以及OD260/OD280，OD260/OD230的比值，將RNA分裝保存于-80℃，備用。

1.2.3 逆轉錄與熒光定量PCR 檢測circRNA和mRNA使用GoScript Reverse Transcription System試劑盒進行逆轉錄，嚴格執(zhí)行操作說明書，每個樣的總RNA量為200 ng。熒光定量PCR使用GoTaq qRCR Master Mix試劑盒，內參基因為β?actin，總反應體系為20 μL。miRNA使用miRNA試劑盒進行逆轉錄和熒光定量PCR，內參基因為U6，總反應體系為25 μL。

基因引物均由Life公司合成，其中circRNA根據其頭尾拼接位點設計特異性引物。本研究涉及的基因引物序列見表1、2。

表1 circRNA、mRNA及內參基因引物序列Tab.1 Primer sequence of circRNA，mRNA and internal reference gene

1.2.4 生物信息學分析 使用RegRNA（http：//re?grna.mbc.nctu.edu.tw/）預測與 circ0023033 結合的miRNA，使用 Targetscan（http：//www.targetscan.org/）預測miRNA下游的mRNA。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有試驗至少重復3次，結果使用2^?ΔΔCt法表示基因的相對表達量，ΔΔCt=（Ct目的基因?Ct內參）處理組?（Ct目的基因?Ct內參）對照組。目的基因相對表達量（處理vs對照）=2^?ΔΔCt。數據采用 SPSS 22.0 進行統(tǒng)計學分析，試驗數據以均數±標準差表示。兩組間比較，滿足正態(tài)分布且方差齊的采用雙側Student'st檢驗，雙側檢驗以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 circ0023033在不同肺癌細胞株中低表達利用circ0023033的特異性引物在BEAS?2B細胞及不同肺癌細胞（H661、H1299、SK?MES?1）中進行檢測發(fā)現(xiàn)，circ0023033在H661、H1299、SK?MES?1細胞中高表達，在H1299細胞中差異表達最顯著。差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

表2 miRNA引物序列Tab.2 Primer sequence of miRNA

圖1 circ0023033在不同肺癌細胞中相對表達量Fig.1 Relative expression of circ0023033 in different lung cancer cells

2.2 circ0023033結合的多個miRNA在肺癌細胞中的表達 選擇了18個miRNA，在BEAS?2B細胞及肺癌細胞H1299中進行檢測發(fā)現(xiàn)，與BEAS?2B細胞進行比較，14個miRNA（miR?1182，miR?143，miR?2115，miR?4252，miR?4318，miR?516b，miR?93，miR?1256，miR?181a?2，miR?4299，miR?432，miR?520f，miR?128，miR?433）在H1299細胞中低表達，4個miRNA在H1299細胞中高表達。差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 生物信息學分析 通過生物信息學分析網站RegRNA，預測到與circ0023033結合的多個miR?NA。經查閱相關文獻預測到的結合強度選擇miR?143，運用生物信息學分析網站Targetscan預測其靶向的mRNA。在預測的mRNA中選擇了4個腫瘤診斷標志物進行進一步檢測研究。見圖3。

圖2 miRNA在肺癌細胞中相對表達量Fig.2 Relative expression of miRNA in lung cancer cells

2.4 circ0023033經miRNA靶向的多個腫瘤診斷標志物mRNA在肺癌細胞中的表達 通過對miR?143靶向mRNA進行篩選后，選擇了其中4個腫瘤標志物（BCL2、KRAS、SMAD3、MAPK1），運用RT?qPCR進行檢測發(fā)現(xiàn)：與BEAS?2B細胞進行比較，BCL2、KRAS、SMAD3和MAPK1的mRNA在H1299細胞中均顯著高表達，這與4種腫瘤標志物本身的功能一致。差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

肺癌是對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，近些年來其發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸上升態(tài)勢。目前肺癌的治療手段主要為手術切除和常規(guī)放/化學治療，患者預后十分嚴峻，5年生存率僅為11%。另一方面，由于缺少早期診斷的依據，肺癌患者確診時腫瘤細胞往往已經發(fā)生了轉移，這也是導致肺癌患者預后不良的主要因素。越來越多的研究報道表明［3］，基因表達與調控功能異常是肺癌發(fā)生和發(fā)展的內因和基礎。其中非編碼RNA的表達異常與肺癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系。JIANG等［4］報道hsa_circ_0007385可以促進非小細胞肺癌（NSCLC）的發(fā)生和發(fā)展。

圖3 生物信息學分析Fig.3 Bioinformatics analysis

圖4 mRNA在肺癌細胞中相對表達量Fig.4 The relative expression of mRNA in lung cancer cells

circRNA的研究雖然目前仍處于起步階段，但是其具有非常重要的生物學功能。大量的研究報道表明［5］，circRNA幾乎參與了整個生物過程，其在轉錄、翻譯以及反轉錄過程中均發(fā)揮了不容忽視的作用。circRNA不僅在生物過程中發(fā)揮作用，還參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展。眾多研究表明［6］，circRNA在許多腫瘤組織與其癌旁組織中的表達具有特異性，因而具有作為新一類腫瘤標志物的潛力。YU等［7］報道circRNAcSMARCA5可充當 miR?17?3p 和 miR?181b?5p“海綿”，進而調控TIMP3的表達，最終抑制肝癌發(fā)生發(fā)展。ZHUANG等［8］報道的circRNA_0005836在活動性肺結核患者外周血單核細胞中明顯下調，可以作為活動性肺結核的新的診斷標志物和治療靶點。本研究從文獻查找到的鼻咽癌circRNA芯片中高表達的circ0023033入手，探究其在肺癌細胞中的作用。通過在不同肺癌細胞株中檢測發(fā)現(xiàn)，circ0023033均為高表達，尤以H1299細胞中最為顯著，提示該基因可能具有癌基因的作用。為進一步探究circ0023033在肺癌細胞中如何發(fā)揮癌基因的作用，筆者使用生物信息學網站預測到了其下游靶向與腫瘤相關的18個miRNA。經RT?qPCR驗證發(fā)現(xiàn)，14個miRNA在H1299細胞中低表達，4個miRNA 高表達。進一步查閱文獻［9?10］結合預測到的結合強度，最終選取miR?143進行下一步探究。而后筆者經生物信息學網址預測到其下游靶向的4個mRNA，經RT?qPCR驗證發(fā)現(xiàn)，BCL2、KRAS、SMAD3和MAPK1在H1299細胞中均顯著高表達，這與文獻報道中4種腫瘤標志物本身的功能一致［11?14］。筆者分析原因認為，circ0023033在肺癌細胞中高表達之后，對其靶向的miRNA吸附作用增強，導致其靶向的miR?143表達下調，miR?143下游靶向的BCL2、KRAS、SMAD3和MAPK1表達上調。

circRNA作為肺癌標志物的研究報道較少，本研究通過對circ0023033在肺癌細胞中的表達和其對下游靶基因的影響檢測發(fā)現(xiàn)，circ0023033具備作為新的肺癌診斷標志物能力，也為進一步探究肺癌診斷方法提供了新的線索。