申枚靈，趙 翀，廖 萍，李 靜，程雪芬，李成成，張 琴，李艷賓，張利莉，趙 珂

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院,四川 成都 611130； 2.四川大學(xué)華西醫(yī)院消化疾病研究室,四川 成都610041;3.四川大學(xué)華西醫(yī)院麻醉研究室,四川 成都 610041； 4.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 阿拉爾 843300)

植物內(nèi)生菌(Endophyte)是指其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部對(duì)宿主植物不構(gòu)成危害的微生物[1]。內(nèi)生菌廣泛存在于各種植物的內(nèi)部組織中[2]，在與植物的長(zhǎng)期共同進(jìn)化中，已成為植物微生態(tài)系統(tǒng)的天然成份，它促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收、適應(yīng)惡劣的生存環(huán)境、抵御病原體的侵害，加強(qiáng)寄主植物體內(nèi)系統(tǒng)的生態(tài)平衡[3]，具有重要的生態(tài)學(xué)作用。放線菌是植物內(nèi)生菌的重要組成部分，是抗生素及其他生物活性物質(zhì)的重要來源。除此之外，放線菌產(chǎn)生的耐熱和抗干燥孢子可以在不利環(huán)境下長(zhǎng)期存活[4]，具有一定的抗逆性，且有大量研究表明，植物內(nèi)生放線菌可以通過多種促生機(jī)制促進(jìn)植物生長(zhǎng)[5-6]。甘草(Glycyrrhizauralensis)為豆科甘草屬多年生草本植物，喜干燥氣候，耐寒，多生長(zhǎng)于干旱、半干旱的荒漠草原，黃土丘陵地帶以及地下水位低的砂質(zhì)中性或微堿土壤，是新疆荒漠區(qū)最主要的植被物種之一[7]，在干旱脆弱的環(huán)境中起著防風(fēng)固沙，保持水土，調(diào)節(jié)氣候等重要作用[8]。在中國(guó)，甘草有著悠久的藥用歷史，是最常用的中草藥品種，具有益氣補(bǔ)中、清熱解毒、祛痰止咳，調(diào)和諸藥等功效[9]。甘草能在塔里木盆地鹽堿荒漠地區(qū)廣泛生長(zhǎng)，其內(nèi)生菌在與宿主協(xié)同進(jìn)化過程中可能同樣具有耐鹽堿、干旱等抗逆能力。但是，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)塔里木盆地甘草內(nèi)生菌的研究多集中于抗菌活性及產(chǎn)生活性物質(zhì)等方面，鮮有抗逆和促生等功能的報(bào)道。因此，本研究以塔里木盆地的光果甘草為研究對(duì)象，分離樣品中的內(nèi)生放線菌，研究?jī)?nèi)生放線菌的多樣性，篩選出具有抗逆和促生功能的菌株，為生物肥料的開發(fā)提供菌種資源，以期提高甘草在鹽堿荒漠和鹽漬化棄耕地中的人工種植量，從而更好地保護(hù)生態(tài)環(huán)境，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品 從塔里木盆地(40°33′51″ N，80°19′55.3″ E)隨機(jī)采集15份生長(zhǎng)健康的野生光果甘草植物樣品。將植物根表的土壤去除，有切口的部位用乙醇消毒，再用蠟封好，放入無菌塑料袋中，保存于4 ℃冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，立即進(jìn)行分離。

1.1.2主要試劑和儀器 溶菌酶、蛋白酶K、MIX、SDS、Tris、EDTA、 16SrRNA擴(kuò)增引物(8-27f、1523-1504R)均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀購(gòu)自Bio-Rad公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3培養(yǎng)基 采用8種分離培養(yǎng)基[10-13]分離樣品內(nèi)生放線菌：LNMS培養(yǎng)基(H1)、ISP3培養(yǎng)基(H2)、HV培養(yǎng)基(H3)、棉子糖-組氨酸培養(yǎng)基(H4)、高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基(H5)、改良高氏Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基(H6)、SCN培養(yǎng)基(H7)、葡萄糖-天冬氨酸培養(yǎng)基(H8)，分別向培養(yǎng)基中添加25 mg·L-1K2Cr2O7，25 mg·L-1安芐青霉素(enzyl peniciliin)作為細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)抑制劑。

菌株純化、活化、保藏培養(yǎng)基：ISP4培養(yǎng)基。

菌株促生作用篩選試劑：生長(zhǎng)素(IAA)顯色液、CAS檢測(cè)液、蒙金娜培養(yǎng)基均參考文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行配制。

1.2 方法

1.2.1植物內(nèi)生放線菌分離、純化 將采集的甘草樣品進(jìn)行嚴(yán)格的表面消毒及消毒效果檢測(cè)[14]。把已經(jīng)表面滅菌的植物樣品，分成根、莖、葉三部分，置于無菌研缽中搗碎后，均勻的鋪撒在分離培養(yǎng)基上，放入28 ℃隔水式培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待放線菌長(zhǎng)出后，用ISP4培養(yǎng)基進(jìn)行菌落純化，并將純化好的菌株保存于ISP4斜面培養(yǎng)基上，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2菌種初步鑒定 觀察菌落的外部形態(tài)如：氣絲、基絲、產(chǎn)生色素的顏色及擴(kuò)散方式、有無孢子產(chǎn)生、是否吐水等情況。接種菌株于ISP4培養(yǎng)基埋片培養(yǎng)7～10 d，革蘭氏染色后用光學(xué)顯微鏡(Zeiss Axio Imager)觀察菌絲形態(tài)，同時(shí)對(duì)樣本進(jìn)冷凍干燥[15]、鍍金，于掃描電鏡(Zeiss EVO 18)下觀察，對(duì)分離菌進(jìn)行初步分類。

1.2.3代表菌株16S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育分析 根據(jù)菌株的形態(tài)特征，選取了代表性菌株進(jìn)行16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析。采用文獻(xiàn)[16]的方法提取代表性菌株DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物送往生工生物工程上海(股份)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序獲得的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，用Clustal X(Version 1.81)進(jìn)行序列的多重比對(duì)分析，MEGA 6.0軟件構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹[17]，確定放線菌的分類地位。

1.2.4甘草內(nèi)生放線菌抗逆特性測(cè)定 甘草內(nèi)生放線菌耐鹽性檢測(cè)：制作NaCl濃度為0、5%、7%、10%、15%、20%的6種ISP4固體培養(yǎng)基，將供試菌株懸液用無菌牙簽點(diǎn)到培養(yǎng)基上，重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，觀察每株內(nèi)生放線菌的生長(zhǎng)情況并記錄結(jié)果。

甘草內(nèi)生放線菌耐酸堿性檢測(cè)：以高氏一號(hào)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，用NaOH、KH2PO4、Na2CO3、KCl、NaHCO3、Na2HPO4·10H2O、檸檬酸鈉、檸檬酸三鈉配置pH反應(yīng)緩沖液，使培養(yǎng)基的pH分別達(dá)到4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，將供試菌株菌懸液用無菌牙簽點(diǎn)到培養(yǎng)基上，做3個(gè)重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，觀察每株內(nèi)生放線菌的生長(zhǎng)情況并記錄結(jié)果。

甘草內(nèi)生放線菌耐旱性檢測(cè)：耐旱放線菌的初篩試驗(yàn)采用聚乙二醇(PEG-6000)人工模擬干旱條件進(jìn)行，用不同濃度的PEG-6000制作ISP4培養(yǎng)基，試驗(yàn)設(shè)置以下 4 個(gè)不同濃度的PEG-6000水平的干旱脅迫液：不加 PEG-6000(對(duì)照)；15%PEG-6000；25% PEG-6000；35% PEG-6000，對(duì)應(yīng)的水勢(shì)分別為：0、-0.278、-0.699、-1.309 MPa。加入PEG-6000的量參照文獻(xiàn)[18]方法。將供試菌株菌懸液用無菌牙簽點(diǎn)到培養(yǎng)基上，重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，觀察每株內(nèi)生放線菌的生長(zhǎng)情況并記錄結(jié)果。

1.2.5甘草內(nèi)生放線菌促生特性測(cè)定 產(chǎn)IAA能力檢測(cè)：菌株產(chǎn)IAA能力參考Gordon和Weber[19]的方法進(jìn)行測(cè)定；產(chǎn)鐵載體能力檢測(cè)：定性測(cè)定菌株產(chǎn)鐵載體能力參照Shin等[20]的方法進(jìn)行；溶磷能力檢測(cè)：將供試菌株接種到PKO培養(yǎng)基上，每株菌重復(fù)3次，置于28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察有無解磷圈及解磷圈的大小。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草植物內(nèi)生菌的分離

采用8種分離培養(yǎng)基從光果甘草的根、莖、葉中共分離得到內(nèi)生放線菌124株，編號(hào)為SCAU7001-SCAU7124。不同分離培養(yǎng)基分離得到的內(nèi)生放線菌數(shù)目有較大的差異(圖1)，分離得到放線菌最多的培養(yǎng)基是H7(SCN)，共分離得到48株放線菌，其次是H2(ISP3)、H1(LNMS)、H4(棉子糖-組氨酸)、H5(高氏Ⅰ號(hào))、H8(葡萄糖-天冬氨酸)、H3(HV)，從H6(改良高氏Ⅱ號(hào))中分離得到的內(nèi)生放線菌數(shù)量最少，共3株。

圖1 不同培養(yǎng)基分離放線菌數(shù)量Fig. 1 The number of actinobacteria isolated from different media

H1-H8分別為L(zhǎng)NMS培養(yǎng)基、ISP3培養(yǎng)基、HV培養(yǎng)基、棉子糖-組氨酸培養(yǎng)基、高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基、改良高氏Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基、SCN培養(yǎng)基和葡萄糖-天冬氨酸培養(yǎng)基

H1-H8: Low-Nutrient Mineral Salts-agar(LNMS)， ISP3， Humic-vitamine(HV)， Histidine-Raffinose， Modified Gause No.1， Modified Gause No.2， Starch-Casein-Nitrate(SCN)， Glucose-Asparagine， respectively.

此外，甘草屬內(nèi)生放線菌在植物不同部位的分布也有較大的差異(圖2)，在植物根和葉中內(nèi)生放線菌數(shù)量較之甘草屬植物莖中的放線菌更為豐富。從根部分離的內(nèi)生放線菌數(shù)量最多，占總數(shù)的54.8%，而莖中分離到的內(nèi)生放線菌數(shù)量?jī)H占10.5%。

2.2 內(nèi)生放線菌形態(tài)觀察

所得菌株在培養(yǎng)基上均產(chǎn)生氣生菌絲和基內(nèi)菌絲，根據(jù)氣絲、基絲的顏色差異，將124株內(nèi)生放線菌初步分為白孢類群、灰色類群、桔紅色類群、粉紅孢類群、灰褐色類群，其中24株具有吐水的特征。從中選取32株代表菌株，顯微觀察菌株具有柔曲、螺旋、頂端卷曲呈球狀的孢子鏈，呈明顯的鏈霉菌特征(圖3)。

2.3 內(nèi)生放線菌16S rRNA序列分析

根據(jù)菌株的形態(tài)特征，選取了32株代表菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列擴(kuò)增。結(jié)果表明32個(gè)代表菌株都屬于鏈霉菌屬，鏈霉菌屬為甘草屬植物內(nèi)生放線菌的優(yōu)勢(shì)種群(圖4)。

2.4 甘草內(nèi)生放線菌的抗逆特性

將甘草內(nèi)生放線菌的菌懸液分別點(diǎn)到不同鹽濃度的高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)在鹽濃度為0時(shí)所有菌株均能生長(zhǎng)。在鹽濃度為5%、7%、10%、15%的培養(yǎng)基上部分菌株能夠生長(zhǎng)，且隨著鹽濃度的變大，內(nèi)生放線菌的耐受性越差，能夠生長(zhǎng)的菌株數(shù)量百分比依次為75%、40.6%、18.8%、6.3%。在鹽濃度為20%的培養(yǎng)基上無菌株生長(zhǎng)。其中菌株SCAU7023和SCAU7036能夠在鹽濃度為15%的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，基于極端鹽環(huán)境為鹽濃度大于120 g·L-1的定義[21]，表明在極端鹽環(huán)境條件下，菌株SCAU7023和SCAU7036內(nèi)生放線菌具有較強(qiáng)的耐受能力(表1)。

a1、b1分別為菌株SCAU7019、SCAU7027的光學(xué)顯微形態(tài)；a2為菌株SCAU7019的掃描電鏡形態(tài)。

a1， b1: Microscopic morphology of SCAU7019, SCAU7027; a2:The scanning electron micrograph of SCAU7019.

對(duì)32株甘草內(nèi)生放線菌耐酸堿性檢測(cè)結(jié)果顯示：當(dāng)pH為4.0或12.0時(shí)，無菌株生長(zhǎng)，在pH為7.0的培養(yǎng)基上，所有放線菌均能正常生長(zhǎng)。培養(yǎng)基pH由7.0向堿性或酸性變化均導(dǎo)致內(nèi)生放線菌生長(zhǎng)率降低，在pH為5.0、6.0、8.0、9.0、10.0和11.0的培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)的菌株數(shù)量百分比依次為3.1%、75%、90.6%、62.5%、18.8%和3.1%，由此可見甘草內(nèi)生放線菌對(duì)堿性環(huán)境的耐受性好于酸性環(huán)境。此外，僅菌株SCAU7023能夠在pH為11.0的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，結(jié)合耐鹽性檢測(cè)結(jié)果，表明該菌株具有較強(qiáng)的耐鹽堿性能力(表1)。

將內(nèi)生放線菌接種至4個(gè)不同PEG-6000濃度的ISP4培養(yǎng)基上，當(dāng)PEG-6000濃度為15%時(shí)，內(nèi)生放線菌的存活率高達(dá)87.5%，PEG-6000 濃度為25%時(shí)存活率為56.3%。然而，隨著PEG-6000濃度的增加，水勢(shì)不斷降低，能生長(zhǎng)的內(nèi)生放線菌數(shù)量越來越少，長(zhǎng)勢(shì)也越來越差(表1)。當(dāng)PEG-6000濃度達(dá)到35%時(shí)，內(nèi)生放線菌均不能正常生長(zhǎng)，表明在水勢(shì)為-1.309 MPa的干旱環(huán)境下，甘草內(nèi)生放線菌難以生存。

2.5 甘草內(nèi)生放線菌的促生特性

對(duì)32株甘草內(nèi)生放線菌代表菌株促生功能進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得32株內(nèi)生放線菌中有65.6%的內(nèi)生放線菌能分泌IAA，分泌的IAA濃度范圍為4.32～28.63 mg·L-1，其中菌株SCAU7019、SCAU7033、 SCAU7038分泌的IAA濃度都在20 mg·L-1以上，菌株SCAU7033分泌的IAA濃度最高。將32株內(nèi)生放線菌接種到CAS平板上，共有16株內(nèi)生放線菌菌落周圍出現(xiàn)黃色暈圈，占總數(shù)的50%，其中菌株SCAU7011、SCAU7027、SCAU7036、SCAU7037產(chǎn)生了2 mm以上的水解圈(表2)。32株內(nèi)生放線菌中僅有8株菌在PKO平板上出現(xiàn)解磷水解圈，且水解圈均小于2 mm。32株甘草內(nèi)生放線菌中具有1項(xiàng)以上促生功能的菌株占90.6%，且菌株SCAU7019、SCAU7027、SCAU7036同時(shí)具有產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體、溶磷3項(xiàng)促生功能，具有產(chǎn)IAA能力的菌株在植物的根、莖、葉中均有分布，但具有產(chǎn)鐵載體和溶磷作用的菌株卻大部分分離自植物根部。

圖4 甘草內(nèi)生放線菌16S rRNA序列N-J系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig. 4 Neighbor-joining phylogenetic tree analysis of 16S rRNA of the endophytic actinomycetes from liquorice

3 討論與結(jié)論

適宜的培養(yǎng)基對(duì)研究植物內(nèi)生可培養(yǎng)放線菌的多樣性至關(guān)重要。培養(yǎng)基中各營(yíng)養(yǎng)成分不同，因此從不同的培養(yǎng)基中分離得到的放線菌數(shù)量與種類也不盡相同，本研究采用8種分離培養(yǎng)基從采自新疆的光果甘草中分離得到內(nèi)生放線菌124株，其中H7(SCN)培養(yǎng)基分離出的放線菌數(shù)量最多，其次是H1(LNMS)、H2(ISP3)培養(yǎng)基，而從H6(改良高氏Ⅱ號(hào))中分離得到的內(nèi)生放線菌數(shù)量最少，表明放線菌偏好無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基質(zhì)。對(duì)32株代表性菌株的16S rRNA測(cè)序結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析表明，在甘草屬植物不同部位中的，鏈霉菌屬放線菌屬于優(yōu)勢(shì)菌群，不僅數(shù)量大，而且種類豐富，表明塔里木盆地甘草內(nèi)生放線菌在鏈霉菌屬內(nèi)的多樣性很高，鏈霉菌屬在這一特殊的生境中具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。有大量研究結(jié)果顯示[22-23]，從不同環(huán)境的草本植物中分離得到的放線菌大多為鏈霉菌，表明鏈霉菌不僅是甘草內(nèi)生放線菌中的優(yōu)勢(shì)種群，同樣廣泛存在于各種生境和各種植物體內(nèi)。Zhao等[24]對(duì)塔里木盆地光果甘草內(nèi)生放線菌多樣性的研究中分離到了4個(gè)屬的放線菌，其多樣性高于本研究，分析原因可能是植物內(nèi)生放線菌的分離受采樣時(shí)間、生長(zhǎng)環(huán)境、宿主的年齡、生長(zhǎng)健康狀態(tài)、培養(yǎng)基種類等諸多因素的影響。因此，要想全面了解植物內(nèi)生放線菌種類及分布情況，不僅要選擇具有不同的碳源、氮源及營(yíng)養(yǎng)成分類型各異的培養(yǎng)基質(zhì)，滿足不同類型放線菌生長(zhǎng)的需要，還應(yīng)該將年齡、生長(zhǎng)狀態(tài)及生境有差異的宿主植物納入研究范圍中，以期從植物中分離得到更多更有用的放線菌資源。除此之外，植株不同部位的內(nèi)生放線菌數(shù)量和種類也不盡相同。從不同組織中分離內(nèi)生放線菌的結(jié)果來看，不同部位內(nèi)生放線菌的數(shù)量和種類存在較大差異。根部的內(nèi)生放線菌數(shù)量和種類均比葉、莖部豐富，而葉的豐富度又高于莖，與李麗等[25]人的研究結(jié)果一致，說明內(nèi)生放線菌在宿主植物中的定殖部位有一定的選擇性，推測(cè)根部的內(nèi)生放線菌豐富度高主要是因?yàn)楦块L(zhǎng)期處于土壤環(huán)境中，與根際微生物“交流”頻繁，大量的根際放線菌通過吸附、滲透等方式侵染宿主植物[26]，并與宿主植物長(zhǎng)期共處，定殖于根部。

表1 甘草內(nèi)生放線菌代表菌株的耐鹽性、耐酸堿性及耐旱性Table 1 Resistance to salt, acid, alkali, and drought in the endophytic actinobacteria of liquorice

+++，長(zhǎng)勢(shì)很好；++，長(zhǎng)勢(shì)良好；+，長(zhǎng)勢(shì)弱；-，不生長(zhǎng)。

+++, grow very well; ++, grow well; +, grow poorly; -, did not grow.

表2 甘草內(nèi)生放線菌促生功能檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of the growth-promoting analysis of the endophytic actinobacteria of liquorice

水解圈大?。?，<1 mm；++，1～2 mm；+++，2～3 mm。

Width of transparent circle zone: +, <1 mm; ++, 1～2 mm; +++, 2～3 mm.

經(jīng)過檢測(cè)，塔里木盆地甘草內(nèi)生放線菌對(duì)各鹽濃度、酸堿度、干旱程度都表現(xiàn)出一定的耐受性，表明所分離的放線菌具有較好的抗逆性。大多數(shù)內(nèi)生放線菌能在0～7%的鹽濃度，pH為6.0～9.0的酸堿度，以及PEG濃度為0～25%的環(huán)境下生長(zhǎng)，其原因可能是甘草主要生長(zhǎng)在中國(guó)北部和西部的干旱荒漠地區(qū)，有很強(qiáng)的抗逆性，其內(nèi)生菌在與宿主協(xié)同進(jìn)化過程中同樣可能具有耐鹽堿、干旱等抗逆能力。表明在獨(dú)特環(huán)境中生長(zhǎng)的植物及其內(nèi)生菌由于長(zhǎng)期適應(yīng)特殊環(huán)境，形成了一些獨(dú)特的生長(zhǎng)、生理機(jī)制和遺傳基因[27]。植物內(nèi)生菌作為植物體內(nèi)特殊的共生生物，在大多數(shù)情況下，它們之間是互惠共生的，一方面內(nèi)生菌通過植物體獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、庇護(hù)和傳播；另一方面寄生的內(nèi)生菌可能通過產(chǎn)生大量的生物活性物質(zhì)或借助于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)宿主植物提供保護(hù)，增強(qiáng)植物抗病、抗蟲、抗干旱脅迫等能力[28]。東鄉(xiāng)野生稻(Oryzarufipogon)是迄今所發(fā)現(xiàn)的世界上分布最北的野生稻，具有抗寒、耐旱、耐瘠、抗蟲等優(yōu)良品質(zhì)，除了其優(yōu)良的遺傳基因外，內(nèi)生菌也被認(rèn)為與這些優(yōu)良品質(zhì)有一定的關(guān)系[29]。周達(dá)[30]更是提出了內(nèi)生菌對(duì)提高逆境脅迫下甘草生長(zhǎng)的科學(xué)依據(jù)，在其對(duì)寧夏烏拉爾甘草內(nèi)生菌的抗逆特性的研究中發(fā)現(xiàn)：菌株G2(Bacilluslicheniformis)、G5(B.pumilus)能夠在試驗(yàn)設(shè)定最高鹽濃度(13%)和最低pH 5和最高pH 11條件下生長(zhǎng)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，菌株G2 、G5可以緩解鹽和干旱脅迫下對(duì)種子萌發(fā)的抑制，菌株G2可以緩解鹽脅迫對(duì)甘草幼苗根和莖生長(zhǎng)的抑制。其作用機(jī)制主要為菌株G2、G5可以緩解鹽脅迫所造成的甘草體內(nèi)自由氧增多，在干旱條件下通過提高抗氧化酶活性來促進(jìn)甘草幼苗清除過多的自由氧。菌株G2 、G5在鹽脅迫下可以通過提高脯氨酸含量促進(jìn)甘草幼苗對(duì)滲透物質(zhì)的調(diào)節(jié)。

大量研究表明，內(nèi)生放線菌還能通過分泌IAA、產(chǎn)生鐵載體、溶磷、固氮等作用促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[31-32]。本研究對(duì)32株代表菌株進(jìn)行促生功能評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，具有產(chǎn)IAA作用的菌株在植物的根、莖、葉中均有分布，但具有產(chǎn)鐵載體和溶磷作用的菌株卻大部分都分離自植物根部。植物內(nèi)生放線菌能夠通過產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體、溶磷等作用直接或間接地促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和增加根部活動(dòng)強(qiáng)度，菌株分泌IAA刺激細(xì)胞伸長(zhǎng)和分裂從而直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)，同時(shí)通過分泌次生代謝產(chǎn)物溶解土壤中的磷礦物為植物生長(zhǎng)提供養(yǎng)分，還可以通過產(chǎn)鐵載體螯合土壤中游離的鐵使土壤中可用的鐵降低至更為缺乏的程度，使病原真菌的繁衍和侵染能力大大下降從而間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)[33]。因此，可以解釋具有產(chǎn)鐵載體和溶磷作用的菌在根部分布較多這一現(xiàn)象。此外，Egamberdieva等[34]的研究發(fā)現(xiàn)：植物生長(zhǎng)激素(赤霉素、生長(zhǎng)素、玉米素和乙烯)可以提高鹽脅迫下小麥種子的萌發(fā)率，且產(chǎn)IAA的菌株可以減輕土壤中的鹽分對(duì)小麥生長(zhǎng)的脅迫并促進(jìn)植物生長(zhǎng)。因此，植物內(nèi)生菌能夠通過產(chǎn)生相應(yīng)的植物激素來提高宿主植物的抗逆性，這也可能是本研究能夠從塔里木盆地的甘草中分離獲得大量產(chǎn)IAA的內(nèi)生放線菌的重要因素。本研究結(jié)果顯示，SCAU7019、SCAU7027和SCAU7036這3株內(nèi)生放線菌同時(shí)具有產(chǎn)IAA、鐵載體和溶磷的能力。此外，這3株菌在耐鹽性、耐酸堿性及耐旱性的檢測(cè)中都表現(xiàn)出了一定的抗性，表明塔里木盆地甘草內(nèi)生放線菌不僅具有較強(qiáng)的抗逆能力，而且具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的潛力。