王靖靖，余 玲，朱 恭，陳香來，胡小文

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020； 2. 蘭州市南北兩山環(huán)境綠化工程指揮部，甘肅 蘭州 730046)

黃花磯松(Limoniumaureum)又名黃花補血草、金色補血草、金匙草等，白花丹科(Plumbaginaceae)補血草屬(Limonium)，多年生旱生泌鹽草本植物[1]。其具有抗鹽堿、抗干旱等特性，對惡劣環(huán)境的適應(yīng)性極強，常見于灘地、流動沙丘、戈壁、荒漠等干旱半干旱荒漠地區(qū)。在我國呼倫貝爾沙地、河西走廊沙地以及華北北部等地均有分布[2-3]。作為干旱荒漠地區(qū)為數(shù)不多的野生花卉之一，黃花磯松有著十分重要的觀賞、生態(tài)和藥用等價值。

黃花磯松在惡劣環(huán)境下能夠生長發(fā)育的前提是種子能夠萌發(fā)。然而，種子萌發(fā)通常是植物生活史最為脆弱的階段，容易受外界環(huán)境因子如溫度、水分、光照等影響[4-5]。溫度是影響植物時空分布的控制因子，對種子萌發(fā)以及出苗起到關(guān)鍵性作用，能夠促進或抑制種子吸水，影響酶促過程[6-7]；光照作為一種信號分子影響種子萌發(fā)，促進或抑制種子休眠，進而調(diào)控種子在適宜條件下的萌發(fā)[8-9]；水分是干旱半干旱地區(qū)種子萌發(fā)的決定因素，尤其是荒漠鹽漬化地區(qū)，主要通過滲透脅迫影響種子的萌發(fā)[10]；鹽分是鹽漬化地區(qū)種子萌發(fā)的限制因子，嚴(yán)重影響該地區(qū)種子的萌發(fā)以及出苗生長；埋藏深度直接影響植物的出苗率以及出苗速率[11]。因此，研究多環(huán)境因子對種子萌發(fā)的影響對于明確黃花磯松在自然條件下的萌發(fā)機制、栽培利用等都具有重要意義。

目前，圍繞黃花磯松引種栽培、組織培養(yǎng)、育苗技術(shù)、化學(xué)成分、超干保存、結(jié)構(gòu)解剖學(xué)以及鹽脅迫機制等方面的研究工作報道較多[12-13]，但有關(guān)其種子萌發(fā)特性的研究比較零散，如李陽春等[14]和王俊年等[15]研究了溫度對其種子萌發(fā)的影響；高天鵬等[16]和馬全林等[17]探究了埋深對其種子萌發(fā)的作用；尤佳等[18-19]探討了鹽脅迫對其種子萌發(fā)的影響機理。這些研究都從單一方面為探究黃花磯松種子的萌發(fā)特性提供了參考。但種子萌發(fā)通常會受到多種環(huán)境因子的影響，因此系統(tǒng)研究多種環(huán)境因子對黃花磯松種子萌發(fā)、出苗以及生理生態(tài)學(xué)特性具重要意義。此外，黃花磯松作為一種旱生泌鹽植物，目前尚不清晰其對干旱和鹽漬化的耐受程度，所以開展黃花磯松種子萌發(fā)對水分和鹽分脅迫的耐受閾值分析研究，可為明確黃花磯松種子抗旱耐鹽性能，發(fā)掘其在荒漠鹽漬化地區(qū)土壤改良方面的潛能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點和時間

本研究于2017年3月至2017年6月在蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院榆中校區(qū)實驗站完成。萌發(fā)試驗于光照培養(yǎng)箱中進行，埋深試驗于智能溫室中進行。

1.2 供試材料

供試種為野生種，于2016年采集于甘肅省民勤縣沙生植物園，種子清選后貯藏于室溫條件下備用。千粒重為(0.73±0.05) g。

1.3 不同環(huán)境因子對黃花磯松種子萌發(fā)的影響

1.3.1溫度和光照 采用培養(yǎng)皿紙上發(fā)芽法，設(shè)置5、10、15、20、25、30、35、40、45 ℃共9個恒溫和15/25、20/30 ℃兩個變溫條件以及12 h光照/12 h黑暗(12 h L/12 h D)、24 h黑暗(24 h D)兩個光照條件。試驗中使用雙層錫箔紙將培養(yǎng)皿包裹嚴(yán)實來模擬全黑暗條件。每個處理設(shè)置4個重復(fù)，每個重復(fù)50粒種子。以胚根突破種皮為標(biāo)準(zhǔn)來判斷種子是否萌發(fā)，萌發(fā)高峰期增加統(tǒng)計次數(shù)，其余時間每24 h統(tǒng)計一次，種子萌發(fā)高峰期過后連續(xù)3 d沒有種子萌發(fā)即視為試驗結(jié)束，試驗期共21 d。全黑暗條件下的樣品僅于試驗結(jié)束后統(tǒng)計一次，以防試驗期內(nèi)統(tǒng)計時遇光影響結(jié)果的可靠性，與光照條件下的樣品同時結(jié)束，以確?？杀容^性。

1.3.2水分脅迫和NaCl脅迫 同上使用培養(yǎng)皿紙上發(fā)芽法，在25 ℃、12 h L/12 h D條件下，根據(jù)Michel和Kaufmann[20]的方法按照公式計算設(shè)置水勢為0(CK)、-0.3、-0.6、-0.9、-1.2和-1.5 MPa的6個PEG-6000溶液以及滲透勢為0(CK)、-0.3、-0.6、-0.9、-1.2、-1.5、-1.8、-2.1和-2.4 MPa的9個NaCl溶液，NaCl溶液對應(yīng)的摩爾濃度依次為0、0.090、0.151、0.213、0.274、0.336、0.398、0.459、0.521 mol·L-1。每個處理設(shè)置4個重復(fù)，每個重復(fù)50粒種子，萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)同上。每24 h統(tǒng)計一次，種子萌發(fā)高峰期過后連續(xù)3 d沒有種子萌發(fā)即視為試驗結(jié)束，脅迫期共14 d。在水分脅迫和鹽脅迫試驗結(jié)束后立即進行恢復(fù)試驗，即將脅迫處理條件下未萌發(fā)的種子轉(zhuǎn)移到加有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，定期統(tǒng)計萌發(fā)個數(shù)直至試驗結(jié)束并且計算恢復(fù)萌發(fā)率，恢復(fù)試驗結(jié)束標(biāo)準(zhǔn)同上，恢復(fù)期為11 d。

1.3.3埋深 埋深試驗采用盆缽法，設(shè)置8個埋深梯度：0(CK)、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 cm，每個處理設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)100粒黃花磯松種子?；|(zhì)沙層和覆蓋沙層購買于榆中縣夏官營鎮(zhèn)沙場，均需過篩(粒徑2 mm)且130 ℃高溫消毒2 h。黃花磯松子葉突出表層即視為出苗，試驗期間每24 h觀察一次出苗情況，種子出苗高峰期過后連續(xù)3 d沒有種子出苗即視為試驗結(jié)束，試驗周期21 d。

1.4 測定指標(biāo)

共測定萌發(fā)率、出苗率、萌發(fā)指數(shù)、出苗指數(shù)、恢復(fù)萌發(fā)率(recovering germination percentage,RGP)[21]、總萌發(fā)率(total germination percentage,TGP)[21]、耐旱(鹽)適宜濃度、耐旱(鹽)半致死濃度、耐旱(鹽)完全致死濃度。

萌發(fā)(出苗)率=(n/N)×100%;

式中：n為供試種子中萌發(fā)(出苗)的種子數(shù)；N為供試種子數(shù)。

萌發(fā)(出苗)指數(shù)=∑(Gt/Dt)；

式中：Gt為供試種子中與Dt相對應(yīng)每天萌發(fā)(出苗)的種子數(shù)；Dt為萌發(fā)天數(shù)。

RGP=[m/(N-n)]×100%；

式中：m為恢復(fù)試驗中萌發(fā)的種子數(shù)；n為脅迫試驗中萌發(fā)的種子數(shù)；N為進行脅迫試驗的總種子數(shù)。

TGP=[(m+n)/N]×100%；

式中：m為恢復(fù)試驗中萌發(fā)的種子數(shù)；n為脅迫試驗中萌發(fā)的種子數(shù)；N為進行脅迫試驗的總種子數(shù)。

耐旱(鹽)適宜濃度：種子萌發(fā)率為對照的75%時所對應(yīng)的滲透勢。

耐旱(鹽)半致死濃度：種子萌發(fā)率為對照的50%時所對應(yīng)的滲透勢。

耐旱(鹽)完全致死濃度：種子萌發(fā)率為0時所對應(yīng)的滲透勢。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2013錄入并作圖， SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析，用Duncan法進行One-way(P<0.05)、Two-way ANOVA分析(P<0.001)和線性回歸分析(P<0.001)，用LSD多重比較法檢驗其差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 溫度和光照對黃花磯松種子萌發(fā)的影響

隨溫度的升高黃花磯松種子萌發(fā)率以及萌發(fā)指數(shù)均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(圖1)。萌發(fā)率在大于30 ℃的高溫以及低于15 ℃時顯著下降(P<0.05)。萌發(fā)指數(shù)在25、30和20/30 ℃時較高，相比于20～30 ℃，5～15和35～45 ℃溫度條件下萌發(fā)指數(shù)均顯著下降(P<0.05)(圖1)。

35和40 ℃時，光照條件下黃花磯松種子萌發(fā)率顯著高于黑暗條件下(P<0.05)(圖1)，其余溫度條件下有無光照不影響黃花磯松種子的萌發(fā)率(P>0.05)。

圖1 溫度和光照對黃花磯松種子萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)的影響Fig. 1 Effect of temperature and light on the germination percentage and index of Limonium aureum

同一因素不同處理間不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Different lowercase letters represent significant differences aming the different treatments under the same factor at the 0.05 level; similarly for the following figures.

雙因素方差分析的結(jié)果表明，溫度、光照以及二者互作均極顯著影響黃花磯松種子的萌發(fā)率(P<0.001)(表1)。

2.2 水分脅迫和NaCl脅迫對黃花磯松種子萌發(fā)的影響

隨著水分脅迫和鹽脅迫的加重，黃花磯松種子的萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)逐漸降低(圖2)。當(dāng)PEG溶液滲透勢為-1.5 MPa時無種子萌發(fā)。然而，當(dāng)NaCl溶液滲透勢為-2.4 MPa時仍有8%的種子能夠萌發(fā)。

在等滲的PEG和NaCl條件下，黃花磯松種子除了萌發(fā)率在0、-0.3和-0.6 MPa以及萌發(fā)指數(shù)在0和-0.3 MPa無顯著差異(P>0.05)(圖2)外，在其他滲透勢下，鹽脅迫條件下的萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)均顯著高于水分脅迫條件下(P<0.05)。

回歸分析結(jié)果表明，無論是干旱脅迫還是鹽脅迫，黃花磯松種子萌發(fā)率和滲透勢均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.001)(表2)，脅迫對種子萌發(fā)率的影響程度為PEG>NaCl，說明PEG脅迫對黃花磯松種子萌發(fā)的抑制作用更強。在這兩種等滲溶液中，種子萌發(fā)的抗旱和耐鹽半致死濃度分別為-0.64和-0.84 MPa。黃花磯松種子萌發(fā)對兩種脅迫的耐受程度為適宜濃度是PEG>NaCl；而半致死濃度值和和完全致死濃度是NaCl>PEG。

表1 溫度、光照及其互作對黃花磯松種子萌發(fā)率的影響的雙因素方差分析Table 1 Two-way ANOVA of the effect of temperature, light and their interaction on the germination percentage of Limonium aureum

圖2 水分脅迫和NaCl脅迫對黃花磯松種子萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)的影響Fig. 2 Effect of water and NaCl stress on germination percentage and index of Limonium aureum

脅迫類型 Stress type決定系數(shù)R2回歸方程 Linear regression 適宜濃度 Suitable concentration/MPa半致死濃度Median lethal concentration/MPa完全致死濃度 Total lethal concentration/MPaPEG0.875***y=97.405+76.095x-0.32-0.64-1.28NaCl0.802***y=79.922+36.972x-0.18-0.84-2.16

***表示在0.001水平上差異顯著。

*** indicate significant differences at the 0.001 level.

隨PEG溶液和NaCl溶液滲透勢的下降，黃花磯松種子的恢復(fù)萌發(fā)率逐漸升高，而總萌發(fā)率呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，在-0.6 MPa時最小(圖3)。在等滲的PEG和NaCl脅迫條件下，黃花磯松種子恢復(fù)萌發(fā)率只有在-0.3 MPa以及總萌發(fā)率在-0.6 MPa時，NaCl顯著高于等滲的PEG(P<0.05)，在其余條件下均無顯著差異(P>0.05)。

2.3 埋深對黃花磯松種子萌發(fā)的影響

隨埋深增加黃花磯松出苗率和出苗指數(shù)均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(圖4)。埋深0.5 cm 時，出苗率與出苗速率達到最大，而后隨埋深增加，出苗率顯著下降(P<0.05)，埋深3 cm及以上時，出苗率為0。

圖3 水分脅迫和NaCl脅迫對黃花磯松種子恢復(fù)萌發(fā)率和總萌發(fā)率的影響Fig. 3 Effect of water and NaCl stress on recovering germination percentage and total germination percentage of Limonium aureum

圖4 埋藏深度對黃花磯松種子出苗率和出苗指數(shù)的影響Fig. 4 Effect of buried depth on seeding emergence percentage and seeding emergence index of Limonium aureum

3 討論

3.1 溫度和光照對黃花磯松種子萌發(fā)的影響

溫度是植物生長發(fā)育過程中一個至關(guān)重要的環(huán)境因子[22]。溫度過低或過高都不利于種子的萌發(fā)和生長，如溫度太低，酶活性過低不足以催化各種代謝反應(yīng)進行，而溫度太高導(dǎo)致酶變性失活[23-24]。本研究表明，黃花磯松種子在5～45 ℃均能萌發(fā)，表明其具有較寬的萌發(fā)溫幅。這與李陽春和劉存琦[14]的研究結(jié)果一致，其研究發(fā)現(xiàn)黃花磯松種子在5～40 ℃均可萌發(fā)。此外，黃花磯松在10～40 ℃條件下萌發(fā)率均超過50%，說明其適宜在較大溫度范圍內(nèi)萌發(fā)建植。隨溫度升高萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，其最適溫度為恒溫25和30 ℃以及變溫20/30 ℃，這與王俊年和李得祿[15]的研究結(jié)果(15～20 ℃)有異議，兩個研究的種子均是采自甘肅省民勤縣沙生植物園，生境相同，但是王俊年和李得祿[15]的試驗材料是當(dāng)年秋季采集，于10月進行萌發(fā)試驗，為新鮮種子；而本研究所用種子經(jīng)過半年時間貯藏。可能隨著貯藏時間的增加，種子會緩慢后熟，休眠釋放，進而改變種子的萌發(fā)行為[25-26]。

光照和溫度一樣，亦是影響種子萌發(fā)和幼苗建成的重要環(huán)境因子。植物種子萌發(fā)究竟是否需要光照的存在，這不僅由植物自身遺傳物質(zhì)決定，還受到外部環(huán)境因子的影響[27]。本研究表明，光照對種子萌發(fā)的影響因溫度而異，如黃花磯松種子在溫度為35和40 ℃的高溫時，光照顯著促進了其種子的萌發(fā)率，而在其余溫度條件下有無光照并不影響黃花磯松種子的萌發(fā)率。說明35和40 ℃的高溫會誘導(dǎo)黃花磯松種子形成次生休眠[4，7-8]，而光照可以作為一種信號分子抑制休眠[25，28]，因此，高溫條件下光照的存在會促進種子萌發(fā)。

3.2 水分脅迫和NaCl脅迫對黃花磯松種子萌發(fā)的影響

植物種子對水分脅迫的響應(yīng)一定程度反映著其抗旱性強弱，而抗旱性強弱代表了植物在干旱環(huán)境中的生存能力[29]。隨著溶液滲透勢逐漸降低，黃花磯松種子的萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)也逐漸降低，這與劉萍等[30]對補血草(Limonium)種子的研究結(jié)果一致；黃花磯松種子在滲透勢為-1.5 MPa時種子萌發(fā)完全受到抑制，而耳葉補血草(L.otolepis)和簇枝補血草(L.chrysocomum)種子在滲透勢為-0.9 MPa時萌發(fā)完全受到抑制[30-31]，表明黃花磯松種子的抗旱性強于耳葉補血草和簇枝補血草。黃花磯松種子的抗旱半致死濃度和完全致死濃度分別為-0.64和-1.28 MPa，大于鹽節(jié)木(Halocnermumstrobilaceum)種子的抗旱半致死濃度(-0.75 MPa)和完全致死濃度(-1.46 MPa)[32]，說明鹽節(jié)木更抗旱，這可能與鹽節(jié)木是矮小半灌木這一特性有關(guān)。

鹽分對植物種子萌發(fā)的影響程度決定著該植物對鹽漬化土壤的適應(yīng)度，鹽溶液通過滲透脅迫阻礙種子吸水和(或)鹽離子效應(yīng)造成離子毒害進而抑制種子萌發(fā)[18,33]。黃花磯松種子萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)均隨著NaCl脅迫的加重而逐漸下降，這和尤佳等[18-19]研究結(jié)果一致。當(dāng)NaCl濃度為0.521 mol·L-1(-2.4 MPa)時，黃花磯松萌發(fā)率為8%。而耳葉補血草和簇枝補血草種子在NaCl濃度為0.4 mol·L-1時萌發(fā)已完全受到抑制，說明黃花磯松的耐鹽性要強于另外兩種補血草[30-31]。此外，黃花磯松種子萌發(fā)期的耐鹽半致死濃度和完全致死濃度分別為0.201 mol·L-1(-0.84 MPa)和0.471 mol·L-1(-2.16 MPa)，小于鹽節(jié)木種子的耐鹽半致死濃度(0.47 mol·L-1)和完全致死濃度(0.83 mol·L-1)[32]，這表明鹽節(jié)木種子相比于黃花磯松種子而言更具耐鹽能力。但與同為補血草屬植物的二色補血草(L.bicolor)以及甜土植物水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)相比，黃花磯松種子的耐鹽半致死濃度大于二色補血草、水稻和大豆的耐鹽半致死濃度[34-35]。

有研究表明，同一植物對等滲的水分脅迫和鹽脅迫的敏感程度不同[32]。本研究中，當(dāng)滲透勢低于-0.6 MPa時黃花磯松種子在鹽脅迫條件下的萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)基本都要高于等滲的水分脅迫條件，并且當(dāng)NaCl滲透勢為-2.4 MPa時仍然有8%的萌發(fā)率。說明鹽脅迫不利于黃花磯松種子萌發(fā)主要是由滲透脅迫造成的，而離子毒害作用較小甚至沒有。究其原因，可能是因為黃花磯松為鹽生植物，少量Na+低濃度鹽可以促進滲透調(diào)節(jié)、降低種子滲透勢、加速種子吸水和刺激呼吸酶產(chǎn)生作用，而PEG為大分子物質(zhì)，不易進入種子內(nèi)部[18，36-37]。

隨水分脅迫和鹽脅迫的加重，黃花磯松種子的恢復(fù)萌發(fā)率逐漸升高，高脅迫條件下的總萌發(fā)率與對照無顯著差異。這表明高強度的干旱脅迫和鹽脅迫并沒有對黃花磯松種子造成不可逆的損害，沒有使種子永久性的喪失萌發(fā)能力，僅是暫時地抑制了種子吸水[29,38]，種子仍保持較高的萌發(fā)潛力。一旦脅迫解除進行復(fù)水萌發(fā)，黃花磯松種子會恢復(fù)其萌發(fā)能力，達到較高的萌發(fā)率。這可能是黃花磯松種子能夠在鹽堿地以及干旱地區(qū)萌發(fā)的關(guān)鍵原因。此外，黃花磯松的總萌發(fā)率隨著兩種脅迫程度的加深呈先降低后升高的趨勢，在中等滲透勢條件下最低。可能是由于在中等滲透勢條件下誘導(dǎo)了黃花磯松種子形成生理休眠，萌發(fā)潛力降低，使得恢復(fù)萌發(fā)率較低，進而總萌發(fā)率最低[39]。有研究表明，鹽生植物主要有耐鹽型和避鹽型兩種生存策略。耐鹽型植物在高鹽條件下主要表現(xiàn)為高萌發(fā)率和(或)高萌發(fā)速率，而避鹽型植物表現(xiàn)為高恢復(fù)萌發(fā)率[21]。黃花磯松在高鹽條件下有高恢復(fù)萌發(fā)率，表明黃花磯松為避鹽型植物?；謴?fù)研究表明，黃花磯松種子總萌發(fā)率都有所增加，這不僅體現(xiàn)了黃花磯松耐旱耐鹽這一大特性，也反映了黃花磯松長期生存于荒漠干旱環(huán)境中，種子萌發(fā)持續(xù)而分散、萌發(fā)速率低，是其在與干旱環(huán)境千百萬年的博弈中而演化出的萌發(fā)適應(yīng)對策[40-41]。這種策略提高了黃花磯松種子的利用率，同時由于其萌發(fā)時間的不一致性，降低了因外界環(huán)境巨變造成物種滅絕的風(fēng)險。

3.3 埋深對黃花磯松種子萌發(fā)的影響

研究結(jié)果顯示，隨著埋藏深度的增加黃花磯松出苗率和出苗速率先升高后下降。黃花磯松種子最適埋藏深度為0.5 cm，這與高天鵬等[16]和馬全林等[17]研究結(jié)果一致。當(dāng)種子置于基質(zhì)表層時，出苗率比較低可能是由于表層水分蒸發(fā)過快，使得水分不能滿足種子出苗所需。當(dāng)埋藏深度達到3和4 cm時沒有種子出苗，可能是由于以下原因造成：1)隨著埋藏深度增加，頂土壓力增大，而黃花磯松種子較小，種子自身能量不足以讓其突破阻礙到達表面[11,42]；2)當(dāng)埋深到達一定程度時，土壤中含氧量滿足不了種子萌發(fā)的氧分壓，種子進行無氧呼吸，呼吸產(chǎn)物對種子產(chǎn)生毒害作用，代謝氣體與周圍氣體環(huán)境之間的相互作用導(dǎo)致了種子休眠或死亡[42]，故黃花磯松種子適合淺播。

4 結(jié)論

綜上所述：1)黃花磯松種子的最適萌發(fā)范圍為25、30和20/30 ℃；2)當(dāng)溫度為35和40 ℃時光照的存在可以更好地促進黃花磯松種子萌發(fā)，光照對黃花磯松種子萌發(fā)的影響依賴于溫度的變化；3)隨著PEG濃度增大黃花磯松種子萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)降低，在-1.5 MPa時無種子萌發(fā)；4)黃花磯松種子萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)隨著NaCl脅迫的加重而逐漸下降，主要是由滲透脅迫造成，離子毒害作用甚微；5)黃花磯松種子適宜播種深度為0.5 cm。