麥艷芬，錢懷萍，胡淑娟，陳仰新，麥雪鸝

(廣東省佛山市第五人民醫(yī)院，廣東 佛山 528211)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs) 簡(jiǎn)稱內(nèi)異癥，是指子宮內(nèi)膜組織(腺體和間質(zhì))在子宮腔被覆內(nèi)膜及子宮以外的部位出現(xiàn)、生長(zhǎng)、浸潤(rùn)，導(dǎo)致反復(fù)出血，繼而引發(fā)疼痛、不孕及結(jié)節(jié)或包塊等病變的疾病[1]。內(nèi)異癥是生育年齡婦女的多發(fā)病、常見病，具有明顯的激素依賴性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在育齡期女性中內(nèi)異癥的發(fā)病率為2%～10%，其中約30%合并有嚴(yán)重痛經(jīng)，30%～50%合并不孕癥，嚴(yán)重地影響著患者的身體健康和生活質(zhì)量。內(nèi)異癥是具有惡性疾病表現(xiàn)的良性疾病，其治療的難點(diǎn)在于其病變廣泛、形態(tài)多樣、具有侵襲性和復(fù)發(fā)性。內(nèi)異癥早期癥狀不明顯，較小、散在及深部的病灶難以通過影像學(xué)檢查及時(shí)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者在癥狀加重后才依靠術(shù)中鏡檢及術(shù)后活檢確診。

細(xì)胞黏附分子1(cell adhesion molecule 1，CADM1)的表達(dá)缺失已經(jīng)被證實(shí)與多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)密切相關(guān)[2-4]。內(nèi)異癥雖為良性病變，但表現(xiàn)出一定的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的特點(diǎn)，與惡性腫瘤的生物學(xué)行為類似。本研究假設(shè)CADM1表達(dá)缺失在內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜脫落、轉(zhuǎn)移的過程中同樣起到促進(jìn)作用，并最終導(dǎo)致異位內(nèi)膜的形成。因此，擬通過從細(xì)胞、蛋白質(zhì)表達(dá)的層面測(cè)定CADM1在異內(nèi)膜、在位內(nèi)膜和正常內(nèi)膜中表達(dá)水平的差異。對(duì)上述假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證，具體試驗(yàn)方法及結(jié)果如下。

1資料與方法

1.1一般資料

受試者收集自2016年9月至2017年6月間在佛山市第五人民醫(yī)院婦科，因痛經(jīng)、慢性腹痛、不孕癥就診的患者共59例。所有患者接受腹腔鏡下取可疑病灶活檢，并經(jīng)病理科行病理檢查確診為子宮內(nèi)膜異位癥。患者年齡19～46歲，平均年齡31.60±5.70歲，病程0.5～6.1年，平均病程3.20±4.70年，平均月經(jīng)周期26.40±5.80天，平均經(jīng)期5.30±1.10天。嚴(yán)格按照納入排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，最終入組子宮內(nèi)膜異位癥患者20例。20例異位內(nèi)膜、20例在位內(nèi)膜均取自入組的受試者。異位內(nèi)膜通過腹腔鏡取得，在位內(nèi)膜通過宮腔鏡或手術(shù)取得；20例正常內(nèi)膜來(lái)自因不孕癥行診斷性刮宮所收取的正常子宮內(nèi)膜及因?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ期(簡(jiǎn)稱CINⅢ)行子宮全切術(shù)的患者。內(nèi)異癥患者的內(nèi)膜和正常內(nèi)膜均在分泌期取材。所取得的所有內(nèi)膜組織均經(jīng)佛山市第五人民醫(yī)院病理科行病理診斷明確組織來(lái)源及性質(zhì)。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn)

包括：①經(jīng)本院病理診斷為子宮內(nèi)膜異位癥；②病情符合美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)(American Society for Reproductive Medicine，ASRM)分期Ⅱ～Ⅳ期；③病灶位于腹腔或盆腔，易于使用腹腔鏡進(jìn)行取材，且取得組織足夠進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)所需；④年齡18至40歲(包括18及40歲)；⑤自愿參加本臨床試驗(yàn)，簽署知情同意書。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn)

包括：①月經(jīng)周期不規(guī)律；②患有婦科惡性疾病，盆腔炎性疾病；③合并有其它惡性疾病；④在1個(gè)月內(nèi)服用了性激素類藥物、芳香化酶抑制劑、達(dá)那唑；⑤其它可能干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的特殊情況。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1 CADM1陽(yáng)性細(xì)胞率的測(cè)定

內(nèi)膜組織細(xì)胞中CADM1陽(yáng)性的比率采用免疫組化染色法進(jìn)行測(cè)定。將取得的內(nèi)膜組織用石蠟包埋制成4μm切片，然后經(jīng)過脫蠟、抗原修復(fù)、過氧化物酶阻斷、血清封閉制成備用切片。CADM1一抗單克隆抗體，生物素標(biāo)記的二抗，DAB顯色，然后進(jìn)一步復(fù)染、脫水、透明、封片。細(xì)胞漿染成棕黃或者棕褐色顆粒視為陽(yáng)性。采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，先在低倍視野下選取染色最深部位，再在高倍視野下選3個(gè)視野數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞率=陽(yáng)性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%，所有樣本計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率，并計(jì)算平均值。

1.3.2 CADM1蛋白的測(cè)定

內(nèi)膜組織中CADM1蛋白的表達(dá)水平采用Western blotting法進(jìn)行測(cè)定。采用細(xì)胞裂解液提取組織總蛋白，取相同質(zhì)量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，用5%BSA室溫封閉2h，加入一抗(CADM1，1:600；GAPDH，1:1 000)4℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1:1 000)室溫孵育12h。將NC膜置于ECL中反應(yīng)1～3 min，曝光、定影。使用Quantity One分析軟件對(duì)Western blotting條帶進(jìn)行定量。以目的蛋白測(cè)定值與GAPDH的比值作為目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1免疫組化染色結(jié)果

通過免疫組化結(jié)果可知，異位內(nèi)膜組織中CADM1染色的細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)最低，在位內(nèi)膜組織中CADM1染色的細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)次之，而正常內(nèi)膜中CADM1細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表1。

注:a為正常內(nèi)膜，b為在位內(nèi)膜，c為異位內(nèi)膜。

表1 內(nèi)膜組織中細(xì)胞染色陽(yáng)性表達(dá)

2.2 Western Blotting結(jié)果

內(nèi)膜組織中CADM1蛋白相對(duì)表達(dá)量在異位內(nèi)膜中最低，在位內(nèi)膜中次之,正常內(nèi)膜中最高。具體見表2、圖2。

表2 內(nèi)膜組織中CADM1蛋白相對(duì)表達(dá)量

圖2不同內(nèi)膜組織中CADM1的蛋白表達(dá)

Fig.2 Protein expression of CADM1 in different endometrial tissues

3討論

3.1子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制

子宮內(nèi)膜異位癥雖然在病理組織學(xué)定性為良性病變，但其生物學(xué)行為具有增生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)等類似惡性腫瘤的特點(diǎn)，又被稱為“良性癌癥”[5]。特殊的生理特性導(dǎo)致內(nèi)異癥遷延難愈，研究者們一直嘗試對(duì)內(nèi)異癥的特殊生物學(xué)表現(xiàn)作出解釋，但目前仍未達(dá)成共識(shí)。早期學(xué)術(shù)界對(duì)于內(nèi)異癥病灶的來(lái)源主要有兩種認(rèn)識(shí)，一種認(rèn)為其來(lái)自于宮內(nèi)內(nèi)膜的脫落轉(zhuǎn)移，包括經(jīng)血逆流轉(zhuǎn)移和淋巴管、靜脈播散兩種學(xué)說(shuō)；另一種認(rèn)為異位內(nèi)膜由腹腔及其他發(fā)病部位具有分化潛能的細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)，即體腔上皮化生學(xué)說(shuō)。此外，較新的研究還提出了誘導(dǎo)學(xué)說(shuō)、胚胎殘留學(xué)說(shuō)、遺傳、激素、細(xì)胞免疫改變等思路。

目前對(duì)于內(nèi)異癥發(fā)病機(jī)理認(rèn)可度較高的是我國(guó)著名婦科學(xué)者郎景和教授提出的“在位內(nèi)膜決定論”，認(rèn)為在位內(nèi)膜的特性決定了內(nèi)膜碎片能夠在異地種植，在位內(nèi)膜的差異是內(nèi)異癥發(fā)病的決定因素，正常內(nèi)膜保有化生的潛能，在由于遺傳、免疫、環(huán)境、激素的綜合作用下，這種潛能被激活并在基因活化、轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)等途徑中發(fā)生了一系列與惡性腫瘤相類似的改變，細(xì)胞最終獲得轉(zhuǎn)移、侵襲、增殖、誘導(dǎo)血管生成等能力，發(fā)展成為內(nèi)異癥。

3.2子宮內(nèi)膜異位癥的生物標(biāo)志物

子宮內(nèi)膜異位癥的生物標(biāo)志物研究對(duì)于早期診斷子宮內(nèi)膜異位癥具有重要的臨床意義，特別是對(duì)于早期超聲沒有明顯可見的卵巢子宮內(nèi)膜異位，盆腔粘連或其他盆腔病變的患者。癌癥抗原125(cancer antigen 125，CA 125)是子宮內(nèi)膜異位癥最廣泛使用的外周生物標(biāo)志物，但是外周血中的CA125水平作為子宮內(nèi)膜異位癥的單一生物標(biāo)志物敏感性低。膜聯(lián)蛋白V(annexin V)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和可溶性細(xì)胞間黏附分子-1(soluble inter-cellular adhesion molecule-1，sICAM-1)是子宮內(nèi)膜異位癥的生物標(biāo)志物[6]，由于缺乏大樣本的數(shù)據(jù)，其特異性只有60%～80%[7]。另外一種研究較為廣泛的是Glycodelin蛋白，研究證明，Glycodelin是一種具有已知血管生成，免疫抑制和避孕作用的子宮內(nèi)膜來(lái)源蛋白，可能促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥和子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)不孕的發(fā)生。 此外，Glycodelin不僅產(chǎn)生于分泌性子宮內(nèi)膜的腺上皮，而且還從子宮內(nèi)膜異位病灶脫落至腹膜液和血清中。在子宮內(nèi)膜異位癥患者中觀察到血漿Glycodelin水平升高[8]。隨著技術(shù)的進(jìn)步和研究的不斷發(fā)展，越累越多靈敏性高，特異性高的子宮內(nèi)膜異位癥生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)。

3.3子宮內(nèi)膜異位癥與CADM1

CADM1屬于細(xì)胞黏附分子中免疫球蛋白超家族成員，屬于抑癌基因的一種。CADM1通過參與細(xì)胞遞質(zhì)(細(xì)胞黏附分子)的生成影響細(xì)胞骨架的構(gòu)建，維持細(xì)胞相互黏附的穩(wěn)定性，此外具有抑制細(xì)胞過度增殖的作用[9]。CADM1最先被證實(shí)對(duì)肺癌具有抑制作用，隨后在結(jié)腸癌、乳腺癌、淋巴瘤等惡性疾病中都發(fā)現(xiàn)了CADM1的低表達(dá)，且其表達(dá)程度與惡性腫瘤的分化程度和轉(zhuǎn)移能力呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)CADM1表達(dá)失活時(shí)或受到抑制時(shí)，細(xì)胞間黏附力下降，易于惡性細(xì)胞的脫落和轉(zhuǎn)移，說(shuō)明了CADM1的表達(dá)降低是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[10]。在本試驗(yàn)中，內(nèi)異癥患者異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜在細(xì)胞層面、蛋白表達(dá)量方面均表現(xiàn)出CADM1低表達(dá)，與正常內(nèi)膜組之間具有明顯的差異(P<0.05)。由此可以認(rèn)為雖然在位內(nèi)膜的生理結(jié)構(gòu)和分布位置仍然在正常內(nèi)膜的范圍，但是分子表達(dá)已經(jīng)發(fā)生異常轉(zhuǎn)變。普遍存在的CADM1的低表達(dá)可能導(dǎo)致非經(jīng)期的異位內(nèi)膜組織或細(xì)胞脫落，隨即經(jīng)輸卵管或血道、淋巴道轉(zhuǎn)移、種植至其他部位。異位內(nèi)膜同樣表現(xiàn)出CDAM1低表達(dá)，可能與其來(lái)源于在為內(nèi)膜，繼續(xù)表達(dá)原組織的分子學(xué)特性相關(guān)。本試驗(yàn)的研究結(jié)果為“在位內(nèi)膜決定論”提供了新的依據(jù)，一定程度上揭示了轉(zhuǎn)移的發(fā)生內(nèi)在機(jī)理，而且證明了在位內(nèi)膜和異內(nèi)膜之間的關(guān)系。

目前，將CADM1已經(jīng)有望成為新的腫瘤標(biāo)志物[11]。而本研究的結(jié)果初步證實(shí)了CADM1在內(nèi)異癥轉(zhuǎn)移性種植的過程中可能起到了與在惡性腫瘤中類似的作用，可能為內(nèi)異癥的早期診斷和治療提供新的思路。