李鵬飛, 郝慶玲, 畢錫麟, 王 鍇, 朱芷葳, 呂麗華(.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西 太谷 03080)

牛卵泡的發(fā)育過程受多方面因素的調(diào)節(jié).對卵泡發(fā)育階段的劃分也較為復(fù)雜，在1927—1986年的大量文獻(xiàn)中，對牛卵泡發(fā)育階段的劃分一直沿用有腔卵泡生長和閉鎖的概念[1].超聲波監(jiān)測技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，為無損傷監(jiān)測和采集特定階段的牛卵泡，并深入研究影響牛卵泡發(fā)育提供了條件.Romereim et al[2]通過基因芯片對牛顆粒細(xì)胞(granulesa cells, GCs)和膜細(xì)胞、大黃體細(xì)胞和小黃體細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組檢測和分析，篩選牛卵泡發(fā)育和黃體形成的調(diào)控基因；Terenina et al[3]通過高通量測序分析豬生長卵泡和閉鎖卵泡GCs表達(dá)譜，篩選出1 684個調(diào)控卵泡發(fā)育的重要基因，其中包括11個調(diào)控閉鎖的標(biāo)記基因.牛卵泡在發(fā)育過程中，原始卵泡經(jīng)募集后進(jìn)入發(fā)育期，隨著卵泡GCs的增殖分化，GCs增大增多，隨之出現(xiàn)卵泡的優(yōu)勢化，即卵泡發(fā)育偏差期的出現(xiàn).偏差期的出現(xiàn)將牛卵泡發(fā)育過程分為兩個階段，即偏差期前和偏差期后的卵泡，偏差期前的第二大卵泡(the second largest follicle at onset of predeviation, PDF2)在發(fā)育過程中可能成為優(yōu)勢卵泡并最終排卵，而偏差期后的第二大卵泡(the second largest follicle at onset of deviation, ODF2)隨著優(yōu)勢化卵泡的出現(xiàn)，最終走向閉鎖.本課題組通過Illumina平臺對牛發(fā)情期內(nèi)出現(xiàn)偏差前的最大卵泡(PDF1)、PDF2、出現(xiàn)偏差后的最大卵泡(ODF1)和ODF2等4個轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了深度測序，對影響牛卵泡發(fā)育的基因進(jìn)行挖掘[4-5]，并對CART、TEDDM1、AGTR2和CMKLR1等部分基因進(jìn)行了深入研究[6-8].本試驗對ODF2和PDF2進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，深入挖掘影響牛卵泡發(fā)育的調(diào)控基因，旨在為進(jìn)一步厘清基因調(diào)控對卵泡發(fā)育的影響提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

選擇6頭性成熟雌性青年牛，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)管理水平下同期發(fā)情處理，每12 h采用B超聲波儀檢測一次并詳細(xì)繪制雙側(cè)卵巢各發(fā)育卵泡變化圖.其中，3頭牛在卵泡波出現(xiàn)偏差前屠宰采集PDF2；另3頭牛在卵泡波出現(xiàn)偏差后屠宰采集ODF2.將各卵泡置于4 ℃的DPBS中待處理.

1.2 方法

1.2.1 GCs的分離及總RNA的抽提 依次將各卵泡置于盛有DPBS的平皿中，一分為二剪開卵泡并用刮刀分離GCs，棄卵泡膜；將GCs和DPBS一并轉(zhuǎn)移至EP管，于2 000 r·min-1離心15 min，棄上清；添加500 μL RNAiso Plus抽提總RNA.

1.2.2 文庫構(gòu)建及測序 分別取各組RNA樣品8 μL，Oligo磁珠富集后裂解；裂解產(chǎn)物作為模板，加入隨機引物及一系列緩沖液合成cDNA第一鏈和第二鏈；用QiaQuick PCR kit試劑盒純化，經(jīng)EB洗脫、末端修復(fù)、加尾及5′和3′接頭；電泳回收片段并進(jìn)行PCR擴增，構(gòu)建完整的cDNA文庫；用Illumina HiSeq 2000平臺測序.

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因的篩選 參考Audic et al[9]的方法篩選差異表達(dá)基因，參數(shù)設(shè)定為：截斷值≥0.5，ODF2-RPKM/PDF2-RPKM≥2，PDF2-RPKM/ODF2-RPKM≥2，F(xiàn)DR校正值的P<0.05，獲得差異表達(dá)基因.

1.2.4 差異表達(dá)基因GO和KEGG通路分析 使用DAVID 6.7在線軟件(https://david.ncifcrf.gov/)對篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG通路分析，文本框輸入基因列表，物種設(shè)定為牛，設(shè)定P<0.05，分別獲得基因功能聚類和KEGG通路分析結(jié)果.

1.2.5 卵泡發(fā)育相關(guān)基因的篩選 選取KEGG通路和GO分析中的關(guān)鍵通路和富集基因，經(jīng)基因功能查詢系統(tǒng)GeneCards(http://www.genecards.org/)篩選與牛卵泡發(fā)育密切相關(guān)的基因.

2 結(jié)果與分析

2.1 高表達(dá)基因的篩選

轉(zhuǎn)錄組測序共獲得35 325個基因.其中，高表達(dá)基因有15 536個(截斷值≥0.5)，表1列出了表達(dá)量最高的10個基因，可見ODF2和PDF2中的高表達(dá)基因表達(dá)差異較小，表明這些高表達(dá)基因貫穿牛卵泡發(fā)育的整個過程，對維持卵泡的正常發(fā)育具有重要作用.如GSTA3參與類固醇合成過程；SERPINE2具有抑制蛋白酶活性的功能；INHA、INHBA和FST具有抑制促卵泡素分泌的作用；也有間接調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因，如SRGN.

表1 轉(zhuǎn)錄組ODF2和PDF2中表達(dá)量最高的基因Table 1 The highest expression genes in ODF2 and PDF2 follicles

2.2 高差異表達(dá)基因的篩選

對高表達(dá)基因進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，共發(fā)現(xiàn)504個差異表達(dá)基因.其中，ODF2相對于PDF2上調(diào)的差異表達(dá)基因有198個；PDF2相對于ODF2上調(diào)的差異表達(dá)基因有306個.表2列出了雙向表達(dá)差異倍數(shù)最高的10個基因及其功能注釋，其中有參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的RN5-8S1和ZKSCAN1，有參與負(fù)調(diào)控卵泡發(fā)育的神經(jīng)肽CARTPT和ULBP3，也有參與免疫調(diào)控的SPP1和BOLA-N.

表2 ODF2和PDF2中高差異表達(dá)基因及其功能1)Table 2 List of high differential expression genes in ODF2 vs. PDF2 and their functions

1)-表示數(shù)據(jù)庫基因功能查詢無結(jié)果.

2.3 ODF2和PDF2轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因的GO分析

對504個差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析，其中，350個基因獲得注釋，分三大類：生物過程占39.49%，細(xì)胞組分占46.96%，分子功能占13.55%(圖1～3).通過GO分析可較為直觀地篩選一些重要基因，如參與細(xì)胞發(fā)育的基因共有37個(圖1)，其中，STK11、ARID4B、SOX4、GREM1和TGFBR3等部分基因在其他轉(zhuǎn)錄組的篩選中也出現(xiàn)過；通過調(diào)節(jié)跨膜受體蛋白激酶活性參與分子功能的基因有NTRK1、TGFBR3、KIT和EPHA2(圖2)；參與胞內(nèi)物質(zhì)組分的基因有182個，參與細(xì)胞骨架形成的基因有39個(圖3).

2.4 ODF2和PDF2轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因的KEGG通路分析

KEGG通路分析結(jié)果(表3)表明，差異表達(dá)基因參與10條顯著富集的信號通路調(diào)節(jié).其中在牛卵泡GCs發(fā)育調(diào)控中研究較多的通路有3條：參與PI3K-Akt信號通路調(diào)節(jié)的基因有12個，參與Wnt信號通路調(diào)節(jié)的基因有11個，參與mTOR信號通路調(diào)節(jié)的基因有4個.

圖1 差異表達(dá)基因生物過程功能注釋Fig.1 Biological process functional annotation of differentially expressed genes

圖2 差異表達(dá)基因分子功能注釋Fig.2 Molecular functional annotation of differentially expressed genes

圖3 差異表達(dá)基因細(xì)胞組分功能注釋Fig.3 Cellular component functional annotation of differentially expressed genes

表3 差異表達(dá)基因KEGG通路功能注釋Table 3 KEGG pathway functional annotation of differentially expressed genes

2.5 卵泡發(fā)育相關(guān)基因的篩選

經(jīng)KEGG通路和GO功能富集分析后，篩選直接與卵泡發(fā)育相關(guān)的功能聚類和信號通路調(diào)控基因進(jìn)行GeneCards功能查詢，共獲得18個與卵泡發(fā)育密切相關(guān)的差異表達(dá)基因，各差異基因表達(dá)倍數(shù)及功能注釋見表4.

表4 卵泡發(fā)育相關(guān)基因的篩選Table 4 Candidate genes associated with follicular development

3 討論

近年來，高通量RNA測序技術(shù)成為轉(zhuǎn)錄組分析的重要工具[10]，尤其在卵巢卵泡發(fā)育和成熟的相關(guān)研究中廣泛應(yīng)用[11].通過全基因組轉(zhuǎn)錄組分析，獲得許多差異表達(dá)基因編碼的信號分子，如GDF9、BAX、BAD、NDUFA13、IFI6和CAV1基因?qū)d羊繁殖力有重要影響[12].同樣，在牛卵泡發(fā)育波中，對黃體生成素波峰前后的卵泡GCs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)部分基因表達(dá)量的上調(diào)對排卵具有重要調(diào)控作用[11].這表明轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)篩選卵泡發(fā)育調(diào)控基因的應(yīng)用效果較好；且Illumina測序平臺具有試驗誤差小，重復(fù)性好的特點[13].因此，本試驗通過Illumina測序技術(shù)對不同生理階段的發(fā)育卵泡進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，旨在進(jìn)一步獲得影響牛卵泡發(fā)育的調(diào)控基因.

磷脂酰肌醇3激酶—蛋白激酶B(PI3K-Akt)作為經(jīng)典信號通路，其活性受類脂磷酸酶PTEN調(diào)節(jié)，PI3Ks通路參與細(xì)胞分化、增殖和凋亡功能的調(diào)節(jié).研究發(fā)現(xiàn)，PI3K與下游蛋白激酶B(PKB或Akt)形成的通路對調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖和存活具有重要作用[14].Ma et al[15]研究表明，雄激素通過PI3K-Akt通路磷酸化作用影響動物正常排卵.卵泡刺激素對小鼠卵泡GCs氧化性損傷具有保護(hù)作用，其機理是通過PI3K-Akt-mTOR通路的激活，使得卵泡刺激素調(diào)節(jié)的氧化誘導(dǎo)自噬激活，保證了卵泡GCs的存活[16].KEGG通路分析表明，有12個基因參與PI3K-Akt信號通路調(diào)節(jié)，其中，STK11、CDK6、MYC和PIK3R3通過細(xì)胞周期、增殖分化和激素分泌調(diào)節(jié)參與牛卵泡的發(fā)育過程.

mTOR是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其C末端TOR區(qū)域與PI3K催化區(qū)高度同源，mTOR通路受多種細(xì)胞信號調(diào)節(jié)，如促有絲分裂生長因子和胰島素等[17]，參與青春期發(fā)育、促性腺激素分泌、卵泡發(fā)育和成熟的調(diào)節(jié)[18].研究表明，阻斷mTOR通路可誘導(dǎo)小鼠有腔卵泡形成的延長[18]；張毅敏等[19]研究也表明，針刺療法治療小鼠卵巢功能早衰，其療效與雌激素處理相當(dāng)，作用機制可能是通過上調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號通路中的基因或蛋白表達(dá)實現(xiàn)的.本試驗結(jié)果表明，STK11、ULK3、PIK3R3和EIF4E2參與了牛卵泡mTOR信號通路的調(diào)節(jié)，其中，STK11、PIK3R3和EIF4E2也參與了PI3K-Akt信號通路調(diào)節(jié)，這也表明在卵泡發(fā)育的過程中，PI3K-Akt通路與mTOR通路互相交織，共同調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育進(jìn)程.

Wnt通路是一組通過細(xì)胞表面受體將信號向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白，該通路分為經(jīng)典Wnt信號通路、非經(jīng)典Wnt信號通路以及Wnt/Ca2+信號通路，3條通路均是通過Wnt-蛋白配體連接卷曲家族受體激活，參與動物胚胎發(fā)育和細(xì)胞增殖[20].Hossein et al[21]研究表明，Wnt信號通路的激活直接誘導(dǎo)小鼠卵泡GCs的終末分化，促進(jìn)卵泡成熟；Aydos et al[22]通過基因芯片技術(shù)對人體多囊卵巢綜合征患者卵泡GCs和卵丘細(xì)胞表達(dá)譜進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果表明，GCs和卵丘細(xì)胞表面的Wnt信號通路受到抑制，影響卵泡和卵母細(xì)胞的成熟，進(jìn)而導(dǎo)致疾病發(fā)生.本試驗共獲得11個基因參與卵泡GCs表面Wnt信號通路的調(diào)控.

4 結(jié)論

經(jīng)牛卵巢ODF2和PDF2轉(zhuǎn)錄組分析，共獲得504個差異表達(dá)基因，獲得10條顯著富集的信號通路可能參與牛卵泡發(fā)育的調(diào)控；篩選出18個可能與牛卵泡發(fā)育密切相關(guān)的基因.