張程飛, 于文濤, 李 敏, 張 慧, 邢冬昊, 陳清西, 沈建國(.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 35000；.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，福建 福州 35000)

水仙屬(NarcissusL.)屬石蒜科(Amaryllidaceae)，約60余種，多數(shù)為多年生鱗球莖觀賞植物，我國有2種1變種[1].其中，黃水仙(NarcissuspseudonarcissusL.)起源于地中海沿岸，包括40多個原生品種，為世界著名鱗球莖花卉[2-3].近年來，黃水仙等進(jìn)境鱗球莖花卉的數(shù)量和貿(mào)易額一直呈增長趨勢.這些進(jìn)境鱗球莖花卉在進(jìn)境時并未進(jìn)行物種鑒定，且通過肉眼觀察和常規(guī)顯微鏡觀察也難以對其開展快速精確鑒定.因此，為保護(hù)和促進(jìn)我國花卉產(chǎn)業(yè)發(fā)展，非常有必要開展黃水仙等進(jìn)境鱗球莖花卉的多目標(biāo)精確鑒定技術(shù)研究.

相對于傳統(tǒng)分類學(xué)中的形態(tài)學(xué)鑒定而言，近年來分子生物學(xué)蓬勃發(fā)展，大量物種的DNA序列被共享到基因庫，使得依據(jù)物種基因序列的分子鑒定成為可能.尤其是2003年Hebert et al提出DNA條形碼以來，該技術(shù)發(fā)展迅速，他提出DNA條形碼的定義：運(yùn)用短的標(biāo)準(zhǔn)的DNA片段，對物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的識別和鑒定[4-5].長期以來，對于植物DNA條形碼的選取多在葉綠體片段上，如matK、rbcL、trnH-psbA、rpoC1、rpoB和nhdJ等基因、片段及其不同組合[6].最近幾年，植物的DNA條形碼研究主要集中在葉綠體基因組和核基因組，包括非編碼區(qū)和編碼區(qū)[7]，葉綠體基因、片段包括matK基因、rbcL基因、trnH-psbA片段和核基因片段ITS，廣泛應(yīng)用于鑒定高等植物類群的研究中[6,8-11].

在水仙屬的分子生物學(xué)研究方面，Santos-Gally et al[2]研究認(rèn)為，水仙屬植物多樣性的形成過程與地中海沿岸的地質(zhì)歷史活動、地中海氣候的形成相關(guān)；Ito et al[12]基于matK基因序列的分子系統(tǒng)學(xué)研究將水仙屬置于石蒜科中的地中海分支.這些研究多著眼于植物系統(tǒng)學(xué)和生物地理學(xué)等方面的研究，而DNA條形碼技術(shù)在水仙屬中的應(yīng)用有待研究.本試驗(yàn)選取4個候選DNA條形碼，對引進(jìn)自荷蘭的黃水仙、多花水仙，結(jié)合中國水仙，進(jìn)行DNA條形碼通用性和鑒定分辨率等研究，旨在為進(jìn)境黃水仙、多花水仙等水仙屬花卉的快速鑒定技術(shù)提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為8個黃水仙品種、1個多花水仙品種和1個中國水仙對比品種(表1).其中，黃水仙和多花水仙品種于2015年自荷蘭引進(jìn)；中國水仙選取漳州水仙作為對比進(jìn)行試驗(yàn).

表1 供試水仙品種名稱Table 1 The tested Narcissus cultivars

各品種供試材料均選取周徑為15～20 cm、球體飽滿、外表無傷痕的健康種球，每個品種選取3個個體，共計30份樣品.

1.2 方法

1.2.1 引物的選取 本試驗(yàn)使用的4組備選DNA條形碼由國際生命條形碼聯(lián)盟植物工作組推薦[6,11]，使用的通用引物序列見表2.

表2 PCR反應(yīng)引物的序列Table 2 Primer sequences for PCR amplification

1.2.2 植物DNA的提取 黃水仙及其外類群選取新鮮植物的葉片部分，每份樣品稱取60 mg，使用植物基因組DNA試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取.

1.2.3 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序 擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25 μL：12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix(北京天根生化科技有限公司)、引物(原始引物濃度10 pmol·μL-1)各1 μL、3 μL 50～200 ng·μL-1DNA模板、7.5 μL dd H2O.

matK反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min，(94℃ 30 s，41 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min) (35、72 ℃ 10 min)；rbcL反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min，(94 ℃ 30 s，48 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min)(35、72 ℃ 10 min)；trnH-psbA反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；(94 ℃ 30 s，47 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min)(35、72 ℃ 10 min)；ITS反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min，(94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min)(35、72 ℃ 10 min).

取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠和1×TAE緩沖液中電泳，核酸染料染色后用凝膠成像系統(tǒng)拍照.擴(kuò)增產(chǎn)物測序委托上海生物工程公司完成.

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 序列信息編輯采用Sequencher 4.1.4軟件完成.采用MEGA 5.0軟件統(tǒng)計不同序列的長度、堿基含量和簡約信息位點(diǎn).采用TaxonDNA軟件進(jìn)行條形碼間隔分析.采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建鄰接樹，分析候選條形碼的鑒定分辨率.

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增效率和測序成功率

表3 引物擴(kuò)增效率和測序成功率Table 3 The success rate of primer amplification and sequencing

在前期工作中，除選取matK、rbcL、trnH-psbA和ITS 4對國際生命條形碼聯(lián)盟植物工作組推薦使用的引物外，還選取了psbH-petB、trnL-trnF、trnG-trnS、rpoB、rpoC1和ITS2 6對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由于這些片段的擴(kuò)增效率和測序成功率較低，最終確定使用國際生命條形碼聯(lián)盟植物工作組推薦的4對引物.從表3可見：除ITS外，其他3組序列的擴(kuò)增效率均為100%；從測序結(jié)果看，matK和rbcL的測序成功率均為100%，而trnH-psbA和ITS部分樣品存在重疊峰和poly結(jié)構(gòu)，對鑒定結(jié)果有一定的影響.

2.2 不同序列的特征

采用MEGA 5.0軟件對4條序列矩陣進(jìn)行分析，結(jié)果(表4)表明：4個候選的DNA條形碼中，核基因片段ITS簡約信息位點(diǎn)最多，占8.97%；葉綠體基因組的matK、rbcL和trnH-psbA片段中，matK序列簡約信息位點(diǎn)有23個簡約信息位點(diǎn)，占序列全長的2.50%；但rbcL和trnH-psbA片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中僅含有6個簡約信息位點(diǎn)，比率為1%左右，表明這兩條DNA片段在水仙屬中相對保守.

表4 4個候選條形碼的基本信息Table 4 The basic information of 4 DNA barcode candidates

2.3 建樹法的分辨率

2.3.1 4個單獨(dú)候選條形碼構(gòu)建的鄰接樹 采用建樹法構(gòu)建鄰接樹，對每個品種進(jìn)行鑒定分析.建樹法鑒定是查看同屬于一個物種(品種)的不同個體是否聚于一支，若能且沒有其他物種(品種)則說明能夠準(zhǔn)確鑒定該物種(品種)，反之則不能準(zhǔn)確鑒定[11].從matK序列構(gòu)建的鄰接樹(圖1)可以看出：塔希提、荷蘭船長、冰花、粉魅力、拉斯維加斯、迪克威爾頓、舒雅和莎樂美8個品種聚于同一支，支持率達(dá)到100%；荷蘭船長、迪克威爾頓和舒雅 3個品種聚于同一支，支持率為65%；粉魅力和莎樂美聚于同一支，支持率為63%；而新娘皇冠和中國水仙聚于同一支，支持率為100%.總體上說，matK條形碼序列具備識別國外9種水仙的能力，且能鑒定出部分品種間的親緣關(guān)系，但中國水仙嵌入黃水仙的分支中.

從trnH-psbA序列構(gòu)建的鄰接樹(圖2)可以看出：塔希提、荷蘭船長、冰花、粉魅力、拉斯維加斯、迪克威爾頓、舒雅和莎樂美8個品種聚于同一支，支持率為87%；塔希提、冰花和拉斯維加斯3個品種聚于同一支，支持率為66%；粉魅力和莎樂美2個品種聚于同一支，支持率為86%；新娘皇冠和中國水仙聚于同一支，支持率為64%.該條形碼序列具備識別國外9種水仙的能力，且能鑒定出部分品種間的親緣關(guān)系，但不能識別出中國水仙和國外水仙.

圖1 基于matK條形碼構(gòu)建的鄰接樹Fig.1 The neighbour-joining tree of matK barcode圖2 基于trnH-psbA條形碼構(gòu)建的鄰接樹Fig.2 The neighbour-joining tree of trnH-psbA barcode

從rbcL序列構(gòu)建的鄰接樹(圖3)可以看出： 塔希提、荷蘭船長、冰花、粉魅力、拉斯維加斯、迪克威爾頓、舒雅和莎樂美8個品種聚于同一支，支持率達(dá)到99%；新娘皇冠和中國水仙聚于同一支，支持率為60%.從鑒定結(jié)果可以看出，rbcL條形碼片段相對其他片段較為保守，具備識別國外9種水仙的能力，但不能鑒定出部分品種間的親緣關(guān)系，也不能識別出中國水仙和國外水仙，可作為輔助條形碼運(yùn)用于水仙屬的物種鑒定.

從ITS序列構(gòu)建的鄰接樹(圖4)可以看出：塔希提、荷蘭船長、冰花、粉魅力、新娘皇冠、拉斯維加斯、迪克威爾頓、舒雅和莎樂美9個品種聚于同一支，支持率達(dá)到100%；中國水仙單聚一支，支持率為99%.作為核基因片段的ITS序列簡約信息位點(diǎn)較多，可以準(zhǔn)確鑒定出中國水仙和國外水仙，但在鑒定國外水仙品種間的親緣關(guān)系時支持率較低且鑒定出的親緣關(guān)系較亂.因此可將ITS條形碼片段作為輔助條形碼進(jìn)行水仙屬的種間鑒定.

2.3.2matK+trnH-psbA+rbcL組合條形碼構(gòu)建的鄰接樹matK、trnH-psbA和rbcL序列均為葉綠體基因片段，將3個片段組合，從組合序列構(gòu)建的鄰接樹(圖5)可以看出：塔希提、荷蘭船長、冰花、粉魅力、拉斯維加斯、迪克威爾頓、舒雅和莎樂美8個品種聚于同一支，支持率為100%；荷蘭船長、迪克威爾頓和舒雅 3個品種聚于同一支，支持率為63%；粉魅力和莎樂美2個品種聚于同一支，支持率為92%；塔希提、冰花和拉斯維加斯3個品種聚于同一支，支持率為60%；新娘皇冠和中國水仙聚于同一支，支持率為100%.該組合條形碼具備鑒定國外9種水仙的能力，且能識別出品種間的親緣關(guān)系，但不能準(zhǔn)確鑒定出國外水仙和中國水仙.

圖3 基于rbcL條形碼構(gòu)建的鄰接樹Fig.3 The neighbour-joining tree of rbcL barcode圖4 基于ITS條形碼構(gòu)建的鄰接樹Fig.4 The neighbour-joining tree of ITS barcode

圖5 基于matK+trnH-psbA+rbcL組合條形碼構(gòu)建的鄰接樹Fig.5 The neighbour-joining tree of matK+trnH-psbA+rbcL combination barcode

2.3.3 ITS+matK+trnH-psbA+rbcL組合條形碼構(gòu)建的鄰接樹 將ITS、matK、trnH-psbA和rbcL4條序列片段組合，構(gòu)建鄰接樹.從構(gòu)建的鄰接樹(圖6)可以看出：塔希提、荷蘭船長、冰花、粉魅力、拉斯維加斯、迪克威爾頓、舒雅和莎樂美8個品種聚于同一支，支持率為100%；荷蘭船長、迪克威爾頓和舒雅 3個品種聚于同一支，支持率為55%；粉魅力和莎樂美 2個品種聚于同一支，支持率為83%；塔希提、冰花和拉斯維加斯 3個品種聚于同一支，支持率為42%；新娘皇冠單聚一支，支持率為100%；中國水仙單聚一支，支持率為100%；新娘皇冠與中國水仙具有一定的親緣關(guān)系.該組合條形碼具備鑒定出中國水仙和國外水仙的能力，能識別出國外水仙品種間的親緣關(guān)系，且可以識別出中國水仙與國外水仙的親緣關(guān)系.

2.4 距離法的分辨率

條形碼間隔是檢驗(yàn)候選條形碼是否能作為該物種DNA條形碼的一個重要判斷，間隔的形成需要同屬內(nèi)種間遺傳距離明顯大于種內(nèi)遺傳距離，且二者之間的差異具有顯著性[13].采用TaxonDNA軟件對序列矩陣進(jìn)行計算分析，得出各候選條形碼及其組合條形碼的種內(nèi)和種間遺傳距離(表5)，進(jìn)而做出各個序列及其組合的條形碼間隔直方圖(圖7).從圖7可以看出，各條形碼及其片段組合均存在明顯的條形碼間隔.其中，ITS+matK、ITS+trnH-psbA、ITS+rbcL和ITS+matK+trnH-psbA+rbcL組合條形碼在0.5%～3.0%有部分重疊，其他條形碼或組合基本不存在種內(nèi)遺傳距離和種間遺傳距離的重疊.單個ITS序列在0.0%～1.5%的種內(nèi)遺傳距離大于種間遺傳距離.

圖6 基于ITS+matK+trnH-psbA+rbcL組合條形碼構(gòu)建的鄰接樹Fig.6 The neighbor-joining tree of ITS+matK+trnH+psbA+rbcL combination barcode

表5 4個條形碼序列及其組合的距離法分辨率Table 5 The resolution of distance method of 4 sequences and combination

圖7 候選條形碼的間隔分布Fig.7 The distribution of DNA barcoding gap of candidate barcode

在Best Match和Best Close Match模式下，物種種間遺傳距離較大的條形碼的分辨率越高；而All Species Barcode模式則要求物種種間遺傳距離較大的同時，種內(nèi)遺傳距離要足夠小才能得到較高的分辨率[14].從表5可以看出，matK、trnH-psbA、rbcL、matK+trnH-psbA、matK+rbcL、trnH-psbA+rbcL和matK+trnH-psbA+rbcL條形碼序列或組合條形碼的Best Match和Best Close Match均為80.00%，且matK、trnH-psbA和rbcL3條序列均為葉綠體片段.ITS+matK、ITS+trnH-psbA、ITS+rbcL和ITS+matK+trnH-psbA+rbcL組合條形碼的Best Match和Best Close Match均為100%，這幾條組合條形碼都包括了核基因的ITS片段，就單個ITS片段而言，Best Match和Best Close Match分別為80.00%和76.67%.在All Species Barcode模式下，ITS+matK、ITS+trnH-psbA和ITS+matK+trnH-psbA+rbcL組合條形碼的分辨率均為100%，但單個ITS片段的分辨率卻僅有10.00%，其他序列或組合條形碼的分辨率均在80.00%以上.

3 討論

DNA條形碼技術(shù)是運(yùn)用一種短的DNA片段對物種進(jìn)行快速的識別和鑒定，是一種新興的分子生物學(xué)技術(shù)，目前已在動物類群中得到充分的研究和運(yùn)用，但在植物類群中仍處于尋找合適的基因片段階段，在水仙屬中尚未見研究報道.DNA條形碼相對于其他鑒定方法有許多優(yōu)點(diǎn)，以DNA序列作為檢測對象，在其個體發(fā)育過程中不會發(fā)生變化，且不用過度依賴形態(tài)學(xué)專家的鑒定經(jīng)驗(yàn)，且準(zhǔn)確度較高，鑒定結(jié)果可以存入相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，二次鑒定可以快速鑒定大量的樣本.

3.1 引物的通用性

通用性是判斷DNA條形碼是否理想的最重要標(biāo)準(zhǔn)之一.在3個葉綠體片段中，rbcL和matK的通用性最高，測序成功率均達(dá)到100.00%，trnH-psbA的通用性次之，這與Peter et al[6]和Group et al[11]的研究結(jié)果一致.

在核基因方面，本試驗(yàn)中的ITS片段的通用性高于它在目前已研究的被子植物中的通用性，但在4個候選條形碼中其通用性仍然是最低的，這一結(jié)論與其他類群的研究結(jié)果[11]一致.本試驗(yàn)的ITS候選條形碼測序結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)多拷貝序列及真菌污染.由于核基因區(qū)域進(jìn)化速率快，故可能獲得較高的鑒定分辨率[15-16]，核基因中的ITS片段曾被推薦為植物潛在的核心DNA條形碼[6,15]；然而，由于它的多拷貝區(qū)域的不一致性進(jìn)化引起了雜交和基因漸滲等現(xiàn)象[17]，從而導(dǎo)致在一些類群中其擴(kuò)增和測序成功率較低，以及在PCR擴(kuò)增中存在真菌污染等問題，導(dǎo)致其沒有成為首批的生命條形碼聯(lián)盟(COBL)植物核心條形碼.最近的研究結(jié)果[11]顯示，核基因中的ITS片段在被子植物中具有約80%的測序成功率，且具有多拷貝和真菌污染等問題也是少數(shù)類群，此結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果相同.因此，本試驗(yàn)支持將ITS列為植物的候選核心條形碼的觀點(diǎn).

3.2 候選DNA條形碼的鑒定分辨率

本試驗(yàn)結(jié)果表明，4種條形碼片段單獨(dú)運(yùn)用均具有一定的鑒定水仙屬物種間的能力，3個葉綠體基因片段可將黃水仙與其他物種分開，但不能區(qū)分中國水仙與多花水仙，原因可能是中國水仙是多花水仙的一個變種，葉綠體基因片段鑒別能力有限；核基因片段ITS序列具有較多的簡約信息位點(diǎn)，可以準(zhǔn)確鑒定出中國水仙和多花水仙，但在鑒定國外水仙品種間的親緣關(guān)系時支持率較低.將4種基因片段組合起來具有較強(qiáng)的鑒定能力，能準(zhǔn)確鑒定出中國水仙和國外水仙，也能識別出國外水仙品種間的親緣關(guān)系，且可以識別出中國水仙與國外水仙具有一定的親緣關(guān)系.

在對候選條形碼序列及其組合條形碼進(jìn)行分析的結(jié)果表明，4個候選條形碼及其組合條形碼均具有條形碼間隔，在一定程度上說明4條DNA片段可以作為水仙屬鑒定的條形碼.在Best Match和Best Close Match模式下對比序列及其組合對水仙屬鑒定的能力，分辨率最高的是ITS+matK、ITS+trnH-psbA、ITS+rbcL和ITS+matK+trnH-psbA+rbcL組合條形碼，均為100%，ITS的Best Close Match分辨率為76.67%，其他均為80.00%.在All Species Barcode模式下，ITS+matK、ITS+trnH-psbA和ITS+matK+trnH-psbA+rbcL組合條形碼的分辨率最高，均為100%，但單個ITS片段的分辨率較低，可能與其進(jìn)化速率較快，種內(nèi)遺傳距離較大有關(guān)，其他候選條形碼或組合條形碼的分辨率均在80.00%以上.從距離分析法的角度上看，ITS+matK、ITS+trnH-psbA、ITS+rbcL和ITS+matK+trnH-psbA+rbcL4條組合條形碼適合用于水仙屬的物種鑒定，從易用性上看，ITS+matK可作為推薦組合條形碼.

綜上，經(jīng)過與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果的比對，DNA條形碼技術(shù)適用于水仙屬的物種鑒定，本類群的推薦DNA條形碼為ITS+matK.由于水仙屬的植物多為園藝栽培植物，品種眾多，每個品種的精確鑒定技術(shù)有待于進(jìn)一步研究.