李 東 張樹琛 時琰麗 李雪清 魯炳懷

(民航總醫(yī)院檢驗科， 北京 100123)

無乳鏈球菌，又稱為B族鏈球菌(group BStreptococcus，GBS)，可定植于孕產(chǎn)婦的下消化道與泌尿生殖道，其攜帶率與種族、地區(qū)與個體因素(如年齡、孕產(chǎn)次)有關[1]，國外文獻[2]顯示的定植率為10%～30%。自20世紀70年代以來，GBS感染后引起新生兒異常受到廣泛的重視。GBS定植后，可通過宮頸口上行，侵入后致宮內(nèi)感染，是圍產(chǎn)期新生兒重要的致病菌。即使患者沒有宮內(nèi)感染，經(jīng)陰道分娩的新生兒，如母體生殖道或直腸攜帶GBS，分娩過程中50%新生兒可攜帶該菌，可引起新生兒腦膜炎、敗血癥、新生兒肺炎等疾病。美國疾控中心(Centers for Disease Control，CDC)[2]于2010年推出的《圍產(chǎn)期GBS疾病預防指南》中，明確指出對35～37孕周的婦女進行陰道/直腸GBS定植篩查。

在我國，由于孕產(chǎn)婦人群常規(guī)篩查GBS并未大規(guī)模普及，國內(nèi)相關研究資料不全，而根據(jù)本實驗室研究[3]表明，增菌后的聚合酶鏈反應GBS檢測陽性率9.6%，低于國外文獻[4-7]的定植水平。為了解北京地區(qū)的GBS的分子流行病學特征與對常用抗菌藥物的耐藥菌譜情況，以便向臨床醫(yī)師提供有效的預防與診治，為制訂符合本國情況的孕產(chǎn)婦宮內(nèi)感染預防與診治指南的確定提供臨床與實驗室的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 GBS菌株收集與鑒定

收集 2016年 7月-2017 年 6月，在民航總醫(yī)院及北京華府婦兒醫(yī)院就診，接受產(chǎn)前檢查的孕晚期婦女陰道/直腸拭子所培養(yǎng)出的GBS菌株，每月取檢出的前8株，共96株。其中民航總醫(yī)院的菌株有82株，北京華府婦兒醫(yī)院收集菌株有14株。菌株的鑒定依據(jù)菌落形態(tài)(血平皿上呈圓形、邊緣整齊、濕潤、灰白半透明菌落，多數(shù)有典型β-溶血環(huán))，顯微鏡下形態(tài)(革蘭陽性鏈狀球菌)，CAMP實驗陽性，初步確定是否為GBS，最終采用VITEK-2微生物鑒定儀鑒定。

1.2 GBS菌株血清學鑒定

目前依據(jù)GBS上莢膜多糖的不同，分為Ia、Ib、Ⅱ～Ⅸ等10個血清型。采用PCR方法對其進行鑒定。具體引物見表1[4-5]，經(jīng)基因測序驗證無誤后使用。

1.3 藥敏質(zhì)控標準

質(zhì)控菌株選擇ATCC 25923金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌 ATCC 49619、ATCC 27853銅綠假單胞菌，質(zhì)控菌株來源于實驗室保存。

1.4 抗菌藥物選擇

上述96株菌均進行藥敏實驗，選用的抗生素包括青霉素、氨芐西林、紅霉素、克林霉素與萬古霉素等，采用微量肉湯法進行藥敏表型試驗，藥敏結果解釋參照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)的2017年標準。

1.5 檢測方法

對所有分離到的目標病原菌，用無菌0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液配置成0.5麥氏濁度的懸液，按照試劑說明書操作，試劑由天津金章科技發(fā)展有限公司提供。

表1 GBS 用于血清型鑒定引物與片段長度Tab.1 Primers and amplified fragment length for the serotype identification of group B Streptococcus

1.6 紅霉素耐藥菌株誘導克林霉素耐藥檢測

紅霉素耐藥和克林霉素敏感或中介的GBS，采用紙片擴散法進行D-抑菌圈試驗。15 μg 紅霉素紙片和 2 μg 克林霉素紙片間距12 mm，35 ℃孵育16～18 h后，與紅霉素相鄰側(cè)抑菌圈邊緣出現(xiàn)“截平”(稱作D-抑菌圈)=誘導克林霉素耐藥。在克林霉素抑菌圈內(nèi)有霧狀生長=克林霉素耐藥，即使無明顯的D-抑菌圈。誘導克林霉素耐藥試驗陽性，應報告分離株“克林霉素耐藥”。

1.7 耐藥基因檢測

針對紅霉素耐藥菌株，提取全基因組，耐藥基因與所用引物如表2所示，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后與BLAST基因數(shù)據(jù)庫在線比對。

2 結果

2.1 篩查GBS菌株血清學分布

96株無乳鏈球菌，最常見的血清型為Ⅲ型(40株，41.7%)，其他血清型V型(18株，18.8%)， Ia型(13株，13.5%)，Ib型 (13株，13.5%)， Ⅱ型 (8株，8.3%)。有4株GBS，PCR法無任何目標條帶，為無法分型菌株(nontypeable，NT)，菌株藥敏分布見表3。

2.2 抗生素耐藥表型

根據(jù)藥敏結果表明，所有菌株均對青霉素、氨芐西林、萬古霉素、頭孢噻肟敏感。71%(68株)GBS對于紅霉素耐藥，69%(66株)對于克林霉素耐藥。紅霉素耐藥菌株中，有63株(65.6%)為cMLSB型，2株(2.1%)為iMLSB 型，M型有5株(5.2%)，L型有3株(3.1%)，而S型占23株(表4)。

2.3 大環(huán)內(nèi)酯耐藥基因型分析

經(jīng)耐藥基因檢測分析后發(fā)現(xiàn)，紅霉素的耐藥主要與ermB基因相關，有81.4%紅霉素耐藥菌株攜帶該基因。

3 討論

GBS早期稱為無乳鏈球菌，因其最早被確認為是牛乳腺炎的重要致病菌，感染該菌牛奶產(chǎn)量下降，故此得名。20世紀70年代以來，GBS被認為是侵入性新生兒感染的首要致病菌，引起廣泛重視[2]。GBS可定植于孕產(chǎn)婦的生殖道/直腸部位，定植可達率10%～30%[2，8]。孕產(chǎn)婦定植GBS是引起新生兒侵襲性感染的首要危險因素。特別是在歐美等發(fā)達國家，GBS是新生兒敗血癥的首位病原菌[9]。

表2 菌株藥敏分布類抗生素耐藥基因與PCR引物Tab.2 Resistance genes and amplification primers of macrolides in group B Streptococcus

表3 96株定植無乳鏈球菌菌株藥敏與MIC值分布Tab.3 Antimicrobial susceptibility testing results and MIC distribution of 96colonized strains of group B Streptococcus

表4 無乳鏈球菌對紅霉素耐藥表型、基因型與血清型相關關系Tab.4 Relationship between erythromycin resistant phenotypes， genotypes and serotypes of group B Streptococcus

MLSB:resistant to macrolides， lincosamides， and streptogramin B. MLSB can be either inducible (iMLSB) or constitutive (cMLSB)

研究[10-13]表明，對于孕晚期婦女生殖道/直腸進行GBS定植篩查，篩查陽性人群在分娩前4 h采用抗生素預防感染，可有效降低新生兒感染的發(fā)生率。在美國，近十余年來的孕產(chǎn)婦GBS篩查預防新生兒感染指南的推廣，使得GBS感染下降顯著[2]。

然而，目前為止，中國大陸地區(qū)孕產(chǎn)婦人群生殖道/直腸定植GBS的情況研究較少，定植、感染等相關數(shù)據(jù)相對缺少，亦未制訂相關預防指南[13]。因此，本研究中對于位于北京東部地區(qū)產(chǎn)科就診的人群進行生殖道/直腸定植GBS定植情況篩查，以了解國內(nèi)GBS菌株的分子流行病學趨勢。

實驗研究結果表明，國內(nèi)人群的GBS血清學分布具有如下特征：血清型Ⅲ為最多見的血清型，占所有菌株的41.8%，該數(shù)據(jù)遠高于世界上其他國家的報道，僅有一篇來自韓國的報道[10]與此相近(該報道中血清型Ⅲ占43.8%)；V型、Ia型、Ib型與 Ⅱ型血清型的分布僅次于血清型Ⅲ型。研究中未見血清型Ⅳ型、Ⅳ型、VⅡ型或 IX型、這兩種血清型在其他亞洲人群進行的研究中亦較少見[11-12]。

目前的指南[2，9]多推薦采用青霉素對于GBS定植的孕產(chǎn)婦在分娩前預防該菌引起的新生兒感染。歐美等國家目前尚未見青霉素耐藥的GBS菌株。但是，亞洲部分地區(qū)，已報道[9，14]發(fā)現(xiàn)對于青霉素或氨芐西林中介的GBS菌株。本研究中96例GBS菌株均對青霉素與氨芐西林敏感，說明在中國β-內(nèi)酰胺抗生素依然可作為GBS定植人群預防感染的首要選擇。

美國CDC指南[2]亦指出，對于青霉素過敏的孕婦，可采用紅霉素或克林霉素替代，然而GBS對于紅霉素與克林霉素的耐藥率不斷上升，引起世界范圍內(nèi)的廣泛關注[15]。GBS對大環(huán)內(nèi)酯獲得性耐藥是通過erm基因(主要為ermB、ermTR)編碼的23S rRNA基因甲基化，使大環(huán)內(nèi)酯與靶位結合力下降引起MLSB表型耐藥。本研究中發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)GBS對紅霉素與克林霉素的耐藥率(分別為70.8%與68.8%)高于歐美國家的耐藥率。同時，表型為cMLSB的GBS菌株占總耐藥菌株的首位，而M表型僅占紅霉素耐藥菌株的5.2%。本研究中發(fā)現(xiàn)的GBS對紅霉素與克林霉素的耐藥率如此之高，表明對于青霉素過敏的患者，采用紅霉素或克林霉素作為替代抗生素預防時，必須進行藥敏實驗。Morozumi等[12]建議，對于大環(huán)內(nèi)酯或林可霉素耐藥的GBS菌株，應采用萬古霉素進行預防。

總之，本研究結果表明北京地區(qū)的GBS菌株的分子流行病學特征與世界其他國家的報道總體相仿，但有其自身特點：①血清型Ⅲ為最多見的血清型；②克林霉素與紅霉素耐藥極高；③未見青霉素與萬古霉素耐藥的菌株。