陳 貴，夏稷子，徐作剛

(黔南州食品藥品檢驗(yàn)所，都勻 558000)

健胃止痛片收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第二冊(cè)，由草豆蔻、烏藥、干姜和曼陀羅浸膏組成，具有溫胃散寒、順氣止痛的功效，主治胃寒、脘腹脹痛。在現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，質(zhì)量控制項(xiàng)目包括性狀和草豆蔻的顯微鑒別、曼陀羅浸膏的化學(xué)鑒別以及片劑通項(xiàng)檢查[1]。草豆蔻為方中主藥，山姜素是草豆蔻中的主要黃酮類(lèi)化合物，具有抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛、止吐、抗癌和抗氧化等作用，且毒性低、安全性好，已普遍應(yīng)用于草豆蔻藥材及其制劑的質(zhì)量控制[2-3]。烏藥具有順氣止痛、溫腎散寒的功效，主要含有揮發(fā)油、異喹啉生物堿和呋喃倍半萜等成分，龍腦為其主要成分之一[4]。本實(shí)驗(yàn)用TLC法對(duì)烏藥和干姜進(jìn)行定性鑒別，用HPLC法測(cè)定山姜素的含量，為更好地控制健胃止痛片的質(zhì)量提供了重要依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 LC-2010AHT型高效液相色譜儀(日本島津公司)；雙光束TU-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；AG135型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；BSA224S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；SK250LHC型超聲波清洗儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；KQ-300DE型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；ZF-20D型紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)。

1.2試藥 曼陀羅、草豆蔻、烏藥和干姜藥材購(gòu)自藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為正品；山姜素對(duì)照品(批號(hào)762-9001)，干姜對(duì)照藥材(批號(hào)120942-201510)，龍腦對(duì)照品(批號(hào)110881-201107)，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純；水為純凈水；其余試劑均為分析純。健胃止痛片(批號(hào)：20160101，20160605，購(gòu)自河南金鴻堂制藥有限公司；批號(hào)160801，購(gòu)自河北百善藥業(yè)有限公司)。

1.3材料 G型硅膠板(青島海洋化工有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1烏藥的TLC鑒別

2.1.1供試品溶液的制備 取健胃止痛片10片，除去糖衣，研細(xì)，加入石油醚(30～60 ℃)20 mL，超聲10 min，濾過(guò)后將濾液自然揮干，加入1 mL乙酸乙酯溶解殘?jiān)?，即得[5-6]。

2.1.2對(duì)照品溶液的制備 取龍腦對(duì)照品，加入乙酸乙酯，制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.1.3陰性對(duì)照溶液的制備 除烏藥外，取其余原藥材適量，按照處方制備不含烏藥的陰性樣品，陰性對(duì)照溶液按照2.1.1項(xiàng)下方法制得。

2.1.4鑒別方法 按照TLC法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則)，將上述供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液各吸取2 μL，點(diǎn)于同一G型硅膠板上，置于展開(kāi)劑為正己烷-乙酸乙酯(8.5∶1.5)的展缸中展開(kāi)，用香草醛硫酸試液作為顯色劑，105 ℃加熱使斑點(diǎn)清晰[7]。供試品在與龍腦對(duì)照品TLC色譜相應(yīng)位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖1A。

2.2干姜的TLC鑒別

2.2.1供試品溶液的制備 取健胃止痛片10片，除去糖衣后研細(xì)，置于錐形瓶中，加入30 mL甲醇，水浴回流提取30 min，濾過(guò)后將濾液置于水浴上蒸干，用30 mL乙醚使殘?jiān)芙?，濾過(guò)后將濾液自然揮干，加入2 mL乙酸乙酯使殘?jiān)芙?，即得[8-9]。

2.2.2對(duì)照藥材溶液的制備 取1 g干姜對(duì)照藥材，按照2.2.1項(xiàng)下方法制得對(duì)照藥材溶液。

2.2.3陰性對(duì)照溶液的制備 除干姜外，取原藥材適量，按照處方制備不含干姜的陰性樣品，陰性對(duì)照溶液按照2.2.1項(xiàng)下方法制得。

2.2.4鑒別方法 按照TLC法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則)，將上述供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和陰性對(duì)照溶液各吸取2 μL，點(diǎn)于同一G型硅膠板上，置于展開(kāi)劑為石油醚(30～60 ℃)-乙醚(2∶1)的展缸中展開(kāi)，置于紫外光燈365 nm處檢視[10]。供試品在與干姜對(duì)照藥材TLC色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的黃綠色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖1B。

圖1TLC圖

A．烏藥：1．健胃止痛片；2．陰性樣品；3．龍腦。B．干姜：1．健胃止痛片；2．陰性樣品；3．干姜。

Fig.1 TLC chromatograms

A．Linderaaggregate(Sims) Kosterm.：1．Jianweizhitong Tablets；2．negative sample；3．borneol.B．ZingiberofficinaleRosc.：1．Jianweizhitong Tablets；2．negative sample；3．ZingiberofficinaleRosc..

2.3山姜素的HPLC測(cè)定

2.3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選定 取適量的山姜素對(duì)照品加甲醇制成掃描用溶液，波長(zhǎng)掃描范圍為200～400 nm，掃描結(jié)果顯示，在208和285 nm處有最大吸收，為了排除溶劑吸收的影響，故選擇285 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3.2色譜條件 Waters Symmetry?C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-水(50∶50)；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：285 nm；體積流量：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。在此條件下，山姜素理論塔板數(shù)大于4 000，檢測(cè)成分與相鄰成分之間達(dá)到基線分離。HPLC圖見(jiàn)圖2。

2.3.3對(duì)照品溶液的制備 取10.55 mg的山姜素對(duì)照品，將其置于50 mL量瓶中，加入甲醇制成山姜素質(zhì)量濃度為211.0 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.3.4供試品溶液的制備 取健胃止痛片樣品，除去糖衣，研細(xì)，取0.3 g，精密稱(chēng)定，置于50 mL量瓶中，加入甲醇40 mL，超聲(功率250 W，頻率40 kHz)20 min，放冷，加入甲醇定容，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.5線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.3.3項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液1 mL，置于2，5，10，50和200 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。取對(duì)照品溶液及上述5個(gè)線性質(zhì)量濃度溶液測(cè)定峰面積。以山姜素對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)，得到回歸方程為y=8 658.2x+698.6(r=1.000 0)，線性范圍為1.055～211.0 μg·mL-1。

圖2HPLC圖

A．對(duì)照品；B．供試品；C．陰性樣品；1．山姜素。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.reference substance；B.sample；C.negative sample；1.alpinetin.

2.3.6精密度實(shí)驗(yàn) 按照2.3.2項(xiàng)下色譜條件，取同一質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，得山姜素峰面積的RSD值為0.15%。結(jié)果表明，該儀器精密度良好。

2.3.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.3.4項(xiàng)下制備的供試品溶液，按照2.3.2項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定供試品溶液制備0，2，4，6，12和24 h后的含量。測(cè)得山姜素含量的平均值為3.04 mg·g-1，RSD值為0.43%。結(jié)果表明，供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取健胃止痛片樣品(批號(hào)20160101)6份，按照2.3.4項(xiàng)下方法制得供試品溶液，進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，按照2.3.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得6份樣品中山姜素的平均含量為3.04 mg·g-1，RSD值為0.60%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.3.9加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取山姜素對(duì)照品9.15 mg，置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.915 mg·mL-1的山姜素加樣回收用儲(chǔ)備液。取已知山姜素含量的樣品(批號(hào)20160101)6份，各0.3 g，分別精密加入加樣回收用儲(chǔ)備液1 mL，按照2.3.4項(xiàng)下方法制備，按照2.3.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算山姜素的加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.10樣品測(cè)定 取3個(gè)批次樣品(批號(hào)：20160101，20160605，160801)，每批次3份，按照2.3.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.3.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果3個(gè)批次樣品中山姜素的含量分別為3.02，3.77和2.05 mg·g-1。

表1山姜素的加樣回收率結(jié)果

Tab.1 Results of the recovery test of alpinetin(n=6)

編號(hào)稱(chēng)取量/g原含有量/mg加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%10.309 60.9350.9151.870102.19101.70.8320.306 40.9250.9151.866102.8430.303 80.9170.9151.848101.7540.308 60.9320.9151.857101.0950.308 50.9320.9151.863101.7560.303 20.9160.9151.835100.44

3 討論

3.1山姜素檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道了山姜素含量測(cè)定時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，包括235，286，294和300 nm等[11-17]，實(shí)驗(yàn)根據(jù)波長(zhǎng)掃描的結(jié)果，選擇了最大吸收波長(zhǎng)285 nm作為山姜素含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2山姜素提取條件的選擇 實(shí)驗(yàn)考察了不同超聲時(shí)間(10，20和30 min)和超聲頻率(33，35，40和50 kHz)對(duì)樣品中山姜素提取的影響，結(jié)果顯示，在超聲頻率40 kHz下提取20 min山姜素提取率較高。

3.3山姜素的HPLC法適用性 實(shí)驗(yàn)考察了不同色譜柱(Waters Symmetry?C18、Agilent ZORBAX SB-C18、Agilent Eclipse XDB-C18、Diamonsil?C18、AlltimaTMC18和依利特Hypersil BDS-C18，規(guī)格均為150 mm×4.6 mm，5 μm)對(duì)樣品中山姜素檢測(cè)的影響。預(yù)實(shí)驗(yàn)中參考相關(guān)文獻(xiàn)選擇了流動(dòng)相為甲醇-水(70∶30)[18-19]，結(jié)果分析時(shí)間較短，大部分色譜柱未能使山姜素峰與相鄰峰基線分離；當(dāng)選擇流動(dòng)相為甲醇-水(50∶50)時(shí)，6種色譜柱得到的色譜圖中山姜素峰形對(duì)稱(chēng)，與相鄰峰均達(dá)到基線分離，說(shuō)明此方法適用性良好。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)建立的烏藥中龍腦的TLC鑒別方法，可有效控制烏藥揮發(fā)性成分的損失。從山姜素含量測(cè)定結(jié)果來(lái)看，不同廠家各批次產(chǎn)品之間存在較大差異，有必要建立含量測(cè)定方法加以控制，確保產(chǎn)品質(zhì)量的均一穩(wěn)定。