廖 嫻，周楚娟，梁芷韻，黃月純

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510006)

助孕丸是廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的醫(yī)院制劑，原方是由女貞子、黃芪、白術(shù)、黨參和續(xù)斷等8味中藥組成的復(fù)方制劑。有健脾固腎之功效，主治脾腎兩虛之胎漏胎動不安等癥，臨床應(yīng)用效果較好，受到廣大患者歡迎。方中黃芪具有補氣升陽、固表止汗等功效[1]，主要含有多糖、黃酮類、皂苷類及氨基酸等化學(xué)成分[2-4]。女貞子來源于木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit．的干燥成熟果實，有滋補肝腎、明目烏發(fā)的功效[1]。現(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，女貞子含有多種類型的化合物，其中主要的有效成分有齊墩果酸、特女貞苷和紅景天苷等，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能、護肝和降血脂等生物活性[5-6]。特女貞苷為化合物中的環(huán)烯醚萜類[7-8]?！吨袊幍洹?015年版一部關(guān)于女貞子的含量測定以特女貞苷為指標(biāo)。目前，助孕丸的檢測標(biāo)準(zhǔn)為性狀及相關(guān)丸劑項下檢查，缺乏相關(guān)的定性和定量指標(biāo)。為有效控制助孕丸的質(zhì)量，作者對方中以粉末入藥的黨參、白術(shù)和續(xù)斷進行了顯微鑒別，對主要藥味黃芪和女貞子分別進行了TLC定性和液相定量研究，初步建立了專屬性強、穩(wěn)定可靠的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀(包括DAD檢測器和 Agilent 1200色譜工作站)，美國 Agilent 公司；Olympus CX41顯微攝像儀(日本奧林巴斯公司)；CAMAG Linomat-5半自動點樣儀，CAMAG ADC2全自動展開儀(瑞士卡瑪公司)；硅膠G預(yù)制板(青島海洋化工廠)；HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；XA105型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 黃芪對照藥材(批號120974-200508)、特女貞苷對照品(批號111926-201401)，均由中國食品藥品檢定研究院提供。助孕丸(批號:160601,161001,161101，制劑中心自制)；甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1顯微鑒別 取本品，研細，置于顯微鏡下觀察：聯(lián)結(jié)乳管直徑12～15 μm，含細小顆粒物(黨參)[9-10]。草酸鈣針晶細小，長10～32 μm，不規(guī)則地填塞于薄壁細胞中(白術(shù))[11]。草酸鈣簇晶直徑至45 μm，存在于淡黃棕色皺縮的薄壁細胞中，常數(shù)個排列成行(續(xù)斷)[12]。結(jié)果見圖1。

圖1顯微鑒別結(jié)果

A.聯(lián)結(jié)乳管(黨參)；B.草酸鈣簇晶(續(xù)斷)；C.草酸鈣針晶(白術(shù))。

Fig.1 Results of microscopic identification

A.connecting tube (Radixcodonopsis)；B.calcium oxalate cluster crystal (Radixdipsaci)；C.calcium acicular crystal (RhizomaAtractylodismacrocephala).

2.2TLC鑒別 取助孕丸5 g，研細，加50 mL乙醇加熱回流20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加質(zhì)量濃度為3 g·L-1的氫氧化鈉溶液15 mL使溶解，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至5～6，用乙酸乙酯15 mL振搖提取，分取乙酸乙酯液，用鋪有無水硫酸鈉適量的濾紙濾過，蒸干濾液，殘渣加1 mL乙酸乙酯溶解，即得。取處方中缺黃芪的陰性對照樣品5 g，按照供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。另取2 g黃芪對照藥材，用上述方法制成對照藥材溶液。按照TLC法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)實驗[1]，吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μL，分別點在同一硅膠G薄層板上，用三氯甲烷-甲醇(10∶1)作為展開劑，展開，取出，晾干，置于氨蒸氣中熏后，在紫外光燈365 nm處檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色熒光主斑點，陰性樣品無干擾。見圖2。

圖2黃芪TLC圖

1.黃芪對照藥材；2～4.供試品(批號161101)；5.黃芪陰性對照。

Fig.2 TLC chromatogram of RadixAstragali

1.RadixAstragalireference substance；2-4.samples (batch number 161101)；5.negative control.

2.3含量測定

2.3.1色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(30∶70)[13]；檢測波長：224 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.3.2對照品溶液的制備 取特女貞苷對照品13.20 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1.320 g·L-1的對照品儲備液，精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得特女貞苷對照品溶液。

2.3.3供試品溶液的制備 取助孕丸粉末2.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL稀乙醇溶液，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，冷卻至室溫，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4專屬性實驗 取女貞子陰性對照樣品2.0 g，精密稱定，按照2.3.3項下方法，制得女貞子陰性對照溶液。分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按照2.3.1項下色譜條件測定，結(jié)果陰性對照在特女貞苷峰相同保留時間位置上未見色譜峰，說明陰性樣品對特女貞苷含量測定無干擾，見圖3。

圖3助孕丸HPLC圖

A.對照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.特女貞苷。

Fig.3 HPLC chromatograms of Zhuyun Pills

A.reference substance；B.sample；C.negative sample；1.specnuezhenide.

2.3.5線性關(guān)系考察 分別精密吸取質(zhì)量濃度為1.320 g·L-1的特女貞苷對照品儲備液0.2，0.5，1.0，1.5和2.0 mL，置于10 mL 量瓶中，分別加甲醇定容至刻度，分別精密吸取10 μL 注入液相色譜儀，測定峰面積。按照2.3.1項下色譜條件進樣分析，測定峰面積。以進樣量為橫坐標(biāo)(x)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)進行線性回歸。特女貞苷的回歸方程及相關(guān)系數(shù)為：y=1 157.3x-20.591(r=0.999 8)。結(jié)果表明，特女貞苷在0.264 0～2.640 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.6精密度實驗 精密吸取特女貞苷對照品溶液10 μL，按照2.3.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測定峰面積RSD值為0.38%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.3.7重復(fù)性實驗 取樣品(批號160601)6份，分別按照2.3.3項下方法制備供試品溶液，進樣分析，結(jié)果特女貞苷的平均含量為1.668 mg·g-1，RSD值為1.12%。結(jié)果表明，該實驗重復(fù)性良好。

2.3.8穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0，2，4，8，12和24 h后進樣分析，測定峰面積，結(jié)果特女貞苷峰面積的RSD值為1.01%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.9回收率實驗 精密稱取已知含量的樣品(批號160601)6份，每份1.0 g，分別加入質(zhì)量濃度為321.2 μg·mL-1的特女貞苷對照品溶液各5 mL，按照2.3.3項下方法制備供試品溶液，進樣分析，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1特女貞苷加樣回收率實驗結(jié)果

Tab.1 Results of recovery test of specnuezhenide(n=6)

取樣量/g樣品中含量/mg加入量/mg測得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%1.0021.6711.6063.24197.76 98.11.561.0041.6751.6063.25198.13 1.0051.6761.6063.21595.83 1.0111.6861.6063.25697.76 1.0051.6761.6063.25998.57 1.0131.6901.6063.305100.56

2.3.10樣品測定 分別取各批號樣品2 g，每批平行操作2次，共6份，精密稱定。分別按照2.3.3和2.3.2項下方法制備供試品溶液和對照品溶液，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各 10 μL，注入液相色譜儀，按照2.3.1項下色譜條件測定，結(jié)果3批樣品中特女貞苷的平均含量分別為1.668，1.673和1.677 mg·g-1。

3 討論

3.1顯微鑒別 本制劑中黨參、白術(shù)和續(xù)斷為直接粉碎后粉末入藥，因此顯微鑒別的專屬性和穩(wěn)定性對制劑的鑒別具有重要意義[14]。在顯微鑒別研究中，黨參的聯(lián)結(jié)乳管、白術(shù)的草酸鈣針晶和續(xù)斷的草酸鈣簇晶均是具有代表性的顯微結(jié)構(gòu)，專屬性強、顯微特征清晰、穩(wěn)定性高，故列入標(biāo)準(zhǔn)。

3.2TLC鑒別 在TLC鑒別實驗中，參考藥典及文獻方法進行TLC鑒別研究[15-16]，以黃芪甲苷為對照品，但黃芪甲苷斑點不清晰，且陰性有干擾。后參考以黃芪對照藥材為對照的TLC方法[1]，以三氯甲烷-甲醇(10∶1)為展開劑，展開，置于氨蒸氣中熏后，置于紫外光燈365 nm處檢視。實驗結(jié)果顯示，供試品色譜中斑點清晰，陰性對照無干擾?？疾炝瞬煌c樣量(5和10 μL)、不同薄層板(青島海洋化工廠硅膠G板和煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所硅膠G板)、不同溫度(6，25和30 ℃)及不同濕度(33%，55%和75%)對黃芪TLC鑒別的影響，結(jié)果表明，點樣量為10 μL，點于青島海洋化工廠硅膠G板時效果較好，而溫度和濕度對黃芪TLC色譜展開的影響相對較小。通過對不同批次的供試品進行分析，表明本實驗建立的黃芪TLC鑒別方法斑點清晰、專屬性強、耐用性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

3.3含量測定 在女貞子的含量測定研究中，大多數(shù)以齊墩果酸為指標(biāo)[17-19]，而特女貞苷對測量女貞子更具有專屬性[13]。在供試品溶液的制備中，比較了甲醇、稀乙醇和體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇等不同溶媒提取方法，結(jié)果稀乙醇的提取效率較高，因此確定了稀乙醇為提取溶劑。同時，對加熱回流1 h和超聲處理20和30 min的不同提取方法進行了比較分析，結(jié)果所測含量無明顯差異，故選用較簡單的超聲處理20 min作為提取方法。參考藥典及文獻[13，20]，女貞子項下含量測定方法選用流動相為甲醇-水，分離效果較好，能達到分離要求。