趙 海

（遼寧省大連市甘井子區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧 大連 116031）

張建勛等[1]對遼寧地區(qū)15家規(guī)?；B(yǎng)殖場的150頭1月齡未免疫仔豬進行豬瘟隱性感染情況血清學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，遼寧地區(qū)豬瘟隱性感染率為36%，與國內(nèi)其他地區(qū)研究結果相比，遼寧地區(qū)感染率數(shù)中等偏高水平。綜合遼寧地區(qū)近幾年豬瘟免疫成果發(fā)現(xiàn)，影響豬瘟疫苗免疫效果較大的因素有首免時間、免疫抑制因素、免疫程序的問題。從遼寧省2012～2013年的檢測結果看，由于免疫程序存在差異，散養(yǎng)豬只是春秋集中免疫，種豬場和商品豬場采用程序免疫方案，種豬場和商品豬場明顯高于散養(yǎng)豬的免疫合格率[2]。本試驗通過選取大連地區(qū)某規(guī)?；i場年齡、體重相近、品種相同的仔豬篩選首免和二免時間與劑量，優(yōu)化規(guī)模化豬瘟免疫程序。

1 材料與方法

1.1 試驗動物種類及其數(shù)量選擇大連地區(qū)3個規(guī)?；i場（即A場、B場、C場），選取年齡、體重相近的母豬，試驗前進行豬瘟空免1個周期，其所產(chǎn)新生仔豬豬場A、B各250頭，豬場C 50頭，共550只，品種為杜洛克。

1.2 試驗試劑豬瘟病毒抗體檢測試劑盒：北京愛德士元亨生物科技有限公司。

1.3 試驗疫苗豬瘟活疫苗（傳代細胞源）：規(guī)格：20頭份/瓶，每頭份至少含10 000個兔體感染量，批準文號：獸藥生字（2016）190591084。

1.4 試驗動物的飼養(yǎng)與管理 各試驗組仔豬分圈飼養(yǎng)，試驗全過程按照兩個規(guī)?；i場常規(guī)標準飼養(yǎng)管理模式進行，保持良好通風，每日清理圈舍，定時飼喂，自由飲水。各試驗組仔豬的飼養(yǎng)管理方法和環(huán)境條件完全一致。

1.5 主要試驗器材與儀器消毒藥品、采血管、注射器、針頭、藥棉、消毒設備、移液器、槍頭、板膜、吸水紙、數(shù)顯恒溫培養(yǎng)箱、離心機、酶標儀等。

1.6 試驗分組設計

1.6.1 確定豬瘟優(yōu)化免疫程序豬場A、B選取體重、年齡相近的新生仔豬，各150頭，品種為杜洛克，隨機均分為3組，即試驗1、2組為不免疫母源抗體消長規(guī)律監(jiān)測組。分別在出生后第1 d、7 d、21 d、28 d、35 d進行前腔靜脈采血，分離血清，監(jiān)測仔豬母源豬瘟抗體水平消長規(guī)律及抗體陽性率變化。試驗3、5組為2頭份組，試驗4、6組為4頭份組，將仔豬母源豬瘟抗體水平下降臨界點作為首免時間，監(jiān)測首免后第7 d、21 d、35 d、42 d抗體水平變化，篩選二次免疫時間及免疫劑量，確定豬瘟優(yōu)化免疫程序。

1.6.2 驗證優(yōu)化的豬瘟免疫程序豬場A、B、C分別選擇年齡、體重相近的新生仔豬各50頭，品種為杜洛克，共150頭，即免疫優(yōu)化A組、B組、C組。21日齡首免2頭份，56日齡二免4頭份，分別在免疫后第35 d、49 d、63 d、77 d、91 d、105 d、119 d監(jiān)測仔豬豬瘟抗體水平變化。

1.7 樣品的處理與保存方法 分別于前腔靜脈采集試驗組仔豬5 mL/頭血液，用高速冷凍離心機4 000 r/min離心10 min，取上層血清分裝，于-20℃避光保存至分析。檢測前，將血清與試劑盒恢復至室溫方可使用。

1.8 樣品的檢測方法

1.8.1 原理IDEXX豬瘟病毒抗體ELISA檢測試劑盒是用來檢測豬血清或血漿中豬瘟病毒抗體的檢測試劑盒。該試劑盒是用病毒抗原包被的微量反應板，利用阻斷ELISA原理來檢測豬血清或血漿中豬瘟病毒抗體。

1.8.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析方法陰性對照的平均OD450大于0.500，陽性對照的阻斷率大于50%，該檢測結果有效。若試驗不成立，有可能是試驗操作失誤造成，應嚴格按照說明書再檢測1次。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析Excel統(tǒng)計表整理數(shù)據(jù)，SPSS Statistics 17.0配對樣本T檢驗進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 豬場 A、 B仔豬母源豬瘟抗體水平消長規(guī)律及抗體合格率變化豬場A、B不免疫母源抗體消長規(guī)律監(jiān)測組仔豬1日齡母源豬瘟抗體合格率最高，分別為90%、86%，但豬瘟抗體水平未達到100%保護，母源豬瘟抗體水平隨日齡的增加而相應降低，第21日齡母源豬瘟抗體合格率為76%、72%，則根據(jù)抗體消長半衰期檢測，在第28日齡時仔豬母源豬瘟抗體合格率低于國家70%合格率的要求，因此，21日齡作為首次免疫時間（見表1）。

2.2 豬場 A、 B仔豬首免后豬瘟抗體水平消長規(guī)律及抗體合格率變化經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，豬場A、B仔豬首免后，豬瘟抗體合格率均在第42天（即63日齡）時低于國家合格率70%的要求，即首免后第35天（即56日齡）作為二次免疫時間。比較2頭份組和4頭份組豬瘟抗體合格率發(fā)現(xiàn)，2頭份組豬瘟抗體合格率整體高于4頭份組豬瘟抗體合格率，說明仔豬首免2頭份劑量產(chǎn)生豬瘟抗體水平較好（見表2、表3）。

表1 豬場A、B試驗1、2組（不免疫母源抗體消長規(guī)律監(jiān)測組）仔豬母源豬瘟抗體合格率變化Table 1Change of the rate of maternal classical swine fever antibody in one and two field tests in group A、B(monitoring group of growth and decline of maternal immune antibodies)

表2 豬場A試驗3、4組（2頭份組和4頭份組）仔豬豬瘟抗體合格率比較Table 2Comparison of pigs'antibody rate of piglets in group 3 and 4(2 and 4 groups)pig farm A trials

表3 豬場B試驗5、6組（2頭份組和4頭份組）仔豬豬瘟抗體合格率比較Table 3 Comparison of pigs'antibody rate of piglets in group 5 and 6(2 and 4 groups)pig farm B trials

2.3 豬場A、 B原有豬瘟免疫程序仔豬豬瘟抗體水平消長規(guī)律 豬場A超前免疫對照組免疫程序為首免超前免疫，35日齡二次免疫，乳前免疫豬瘟活疫苗2頭份，免疫后1日齡仔豬豬瘟抗體水平達到最高，合格率為92%，隨著日齡的增大，仔豬豬瘟抗體合格率相應降低，二次免疫豬瘟活疫苗2頭份后，仔豬豬瘟抗體水平有所上升，但難以維持較高的水平，豬瘟抗體合格率逐漸低于國家70%的合格率要求（見表4）。

豬場B常規(guī)免疫對照組免疫程序為首免28日齡，70日齡二次免疫，28日齡首免豬瘟活疫苗2頭份，免疫后仔豬豬瘟抗體水平達到最高，合格率為94%，隨著日齡的增大，仔豬豬瘟抗體合格率逐漸降低，二次免疫豬瘟活疫苗2頭份后，仔豬豬瘟抗體水平有所上升，但難以維持較高的水平，豬瘟抗體合格率逐漸低于國家70%的合格率要求（見表5）。

2.4 驗證試驗豬場A、B、C在21日齡首免豬瘟活疫苗2頭份，56日齡進行二次加強免疫豬瘟活疫苗4頭份，仔豬豬瘟抗體合格率變化（見表6）。

2.5 原場免疫程序與優(yōu)化免疫程序效果比較統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，首免與二免后，豬場A優(yōu)化的免疫程序抗體水平極顯著（P＜0.01）高于原場免疫程序；首免后與二免后7 d，豬場B優(yōu)化的免疫程序豬瘟抗體水平顯著（P＜0.05）高于原場免疫程序，二免后21 d、35 d、49 d，豬場B優(yōu)化的免疫程序豬瘟抗體水平極顯著（P＜0.01）高于原場免疫程序（見表7）。

表4 豬場A超前免疫對照組仔豬豬瘟抗體合格率變化Table 4 Changes in the passing rate of swine fever antibody in piglets with a pre-immune control group

表5 豬場B常規(guī)免疫對照組仔豬豬瘟抗體合格率變化Table 5 Changes of the passing rate of swine fever antibody in piglets with routine immunization in pig farm B

表6 豬場A、B、C優(yōu)化豬瘟免疫程序豬瘟抗體合格率變化Table 6 Pig farm A,B,C optimization of swine fever immunization program swine fever antibody pass rate change

圖1 豬場A、B、C優(yōu)化豬瘟免疫程序豬瘟抗體水平變化Fig.1 Pig farm A,B,C optimization of swine fever immunization program swine fever antibody level changes

表7 豬場A、B前后免疫程序豬瘟抗體合格率的比較Table 7 Comparison of Passion Rate of Classical Swine Fever Antibody in A and B farms

3 討論

3.1 豬場 A、B仔豬母源豬瘟抗體水平消長規(guī)律與抗體合格率變化分析仔豬通過吮吸母豬的初乳，被動地獲得母源豬瘟抗體的保護，即獲得性免疫[3]。仔豬母源豬瘟抗體水平較高會中和豬瘟疫苗而不產(chǎn)生豬瘟抗體，間接影響豬瘟疫苗免疫效果，若在仔豬母源豬瘟抗體水平過低后首免會出現(xiàn)免疫空白期，易受環(huán)境中豬瘟病毒的感染[4]。因此，最佳首免日齡是仔豬母源豬瘟抗體水平降到最低臨界保護值，一方面避免母源抗體的干擾，另一方面維持血清抗體效價[5]。據(jù)報道，由于母豬免疫豬瘟疫苗的時間和機體免疫應答的能力不同，母源抗體持續(xù)的時間不盡相同，一般母源豬瘟抗體的半衰期為14 d左右[6-7]。母源豬瘟抗體水平隨著仔豬日齡的增加逐漸從高水平下降至臨界保護水平（抗體陽性率50%，平均阻斷率40%），一般母源抗體對仔豬的保護周期在28～42 d之間，譚良溪等[8]的研究與張新成等[6]所報道基本一致。

本試驗通過豬場A、B仔豬母源豬瘟抗體水平消長規(guī)律測定發(fā)現(xiàn)，豬場A、B不免疫母源抗體消長規(guī)律監(jiān)測組仔豬1日齡母源豬瘟抗體合格率最高分別為90%、86%，在21日齡豬瘟抗體合格率高于國家合格率70%的要求，35日齡豬瘟抗體合格率低于國家合格率70%的要求，檢測半衰期28日齡仔豬母源豬瘟抗體合格率均低于國家70%合格率的要求，因此，21日齡作為首次免疫時間。羅先等[9]試驗結果發(fā)現(xiàn)，仔豬出生后血清豬瘟抗體陽性率在5～10日齡間可達到100%，15日齡后血清豬瘟抗體陽性率逐漸降低，在25日齡左右達到臨界保護值。Vandeputte等[10]試驗發(fā)現(xiàn)，仔豬哺乳2h后就可以檢測到母源豬瘟抗體且持續(xù)49日齡以上。陳西釗等[11]利用正向間接凝血抑制試驗檢測新生仔豬血清母源豬瘟抗體水平，結果發(fā)現(xiàn)，20～25日齡時，所有仔豬母源豬瘟抗體水平均在保護值以上，20日齡仔豬母源豬瘟抗體陽性率達到92.8%，25日齡仔豬母源豬瘟抗體陽性率下降到62.5%，可能與仔豬21日齡斷奶有關。母豬通過乳汁將母源抗體傳遞給仔豬，而仔豬母源豬瘟抗體水平持續(xù)時間與母豬自身豬瘟抗體水平及仔豬吃初乳情況有關[12]。陳明凱等[13]研究，仔豬比較適合免疫的時機在低母源抗體情況下，隨著免疫劑量的增加，抗體陽性率不斷升高，抗體離散度也不斷縮小，四組免疫組在免疫兩次傳代細胞源豬瘟活疫苗后，1頭份的免疫劑量抗體陽性率和離散度是最好的。因此，本試驗監(jiān)測母源豬瘟抗體水平仔豬在21～35日齡迅速下降，且本地區(qū)生豬飼養(yǎng)中，仔豬一般在21日齡斷奶，為保證仔豬機體豬瘟抗體水平，且不受豬瘟病毒感染，仔豬最佳首免日齡在21日齡，避免首免日齡過晚，出現(xiàn)免疫空白期。

本試驗結果與李儒曙等[14]、李明義等[15]、羅勇等[16]研究豬瘟母源抗體消長規(guī)律的試驗結果相似，于21日齡首次免疫豬瘟疫苗。但也與某些試驗結果不同，在于豬的品種、飼養(yǎng)管理模式、檢測試劑盒等因素的影響。

3.2 豬場A、 B仔豬首免后豬瘟抗體水平消長規(guī)律及抗體合格率變化分析豬場A、B仔豬在21日齡首免后第7天（即28日齡），仔豬豬瘟抗體合格率最高，隨著日齡增加，豬瘟抗體合格率相應下降，在首免后第35天（即56日齡）豬瘟抗體合格率高于國家合格率70%的要求，半衰期第42天（即63日齡），豬瘟抗體合格率低于國家70%合格率的要求，有受豬瘟病毒感染的風險，因此，需要進行二次加強免疫，提高仔豬豬瘟抗體水平，避免豬瘟病毒侵襲豬群，即首免后35 d（即56日齡）作為二次免疫時間。2000版《中國獸用生物制品規(guī)程》中明確豬瘟疫苗推薦免疫程序，即無豬瘟疫病流行地區(qū)，仔豬斷奶后體內(nèi)無母源抗體，接種豬瘟疫苗一次即可；若是豬瘟疫病流行地區(qū)，仔豬在21～30日齡和65日齡左右分別接種豬瘟疫苗一次。本試驗優(yōu)化的豬瘟免疫程序為首免21日齡，二免56日齡，此免疫程序與《中國獸用生物制品規(guī)程》相近。陳果亮[17]研究規(guī)模化豬場豬瘟疫苗群體免疫程序試驗發(fā)現(xiàn)，免疫程序為21～56日齡免疫試驗小組，試驗組內(nèi)個體在一免和二免后抗體都呈上升趨勢，試驗指出，在抗體陰性群體中，21日齡首免是可行的，首免和二次加強免疫時隔3周以上，免疫效果都是可行的，這與本試驗結果相似。

3.3 豬場A、 B仔豬原有豬瘟免疫抗體水平消長規(guī)律分析豬場A、B超前免疫對照組、常規(guī)免疫對照組仔豬豬瘟免疫程序免疫，首免后，隨著日齡的增大，仔豬豬瘟抗體合格率相應降低，二次免疫后，仔豬豬瘟抗體水平有所上升，但仔豬豬瘟抗體合格率相應降低，且難以維持較高而穩(wěn)定的豬瘟抗體水平。因此，說明豬場A、B原有豬瘟免疫程序不適合該場仔豬免疫，免疫效果不理想。

新生仔豬吃初乳前注射豬瘟疫苗，稱之為“乳前免疫”或“零時免疫”，可達到彌補仔豬母源豬瘟抗體不足的情況，預防仔豬初生因體內(nèi)母源豬瘟抗體不足而感染豬瘟病毒[18]。豬場A采用超前免疫的方法，可避免母源豬瘟抗體的干擾，但隨著仔豬日齡的增長，豬瘟抗體水平不斷下降，難以抵御豬瘟感染的風險，因此，35日齡加強免疫，但仔豬豬瘟抗體水平不能穩(wěn)定維持在高水平上。張大華等[19]通過ELISA檢測方法對比三種豬瘟疫苗免疫程序的研究結果顯示，仔豬超前免疫（0，60）的免疫效果優(yōu)于其他方法。曲哲會等[20]通過比較三種豬瘟疫苗免疫程序的研究結果顯示，仔豬（0，35，75）的免疫效果優(yōu)于其他方法。由此說明，豬場A采用超前免疫雖然可更大程度的保護仔豬不受豬瘟感染，但二次加強免疫時間過早，不利于仔豬產(chǎn)生豬瘟抗體，而后再不進一步加強免疫，就造成仔豬豬瘟抗體水平難以穩(wěn)定且不斷下降。許多研究也表明，由于新生仔豬免疫器官發(fā)育不健全，超前免疫存在諸多的風險，如造成仔豬免疫副反應[21]、阻礙仔豬生長發(fā)育等。嚴達偉等[22]研究，仔豬14～28日齡為防治豬瘟的一個空白區(qū)，為防止仔豬感染豬瘟，正常仔豬豬瘟最佳首免日齡應在14～28日齡。豬場B仔豬豬瘟抗體水平隨日齡降低，且不能穩(wěn)定維持較高豬瘟抗體水平，可能是由于首免時間過晚，仔豬體內(nèi)母源豬瘟抗體水平隨日齡降低，達不到保護力。

綜上所述，為達到更好的仔豬豬瘟免疫效果，既要選擇優(yōu)質(zhì)的豬瘟疫苗，又要根據(jù)母豬自身抗體水平和仔豬母源抗體水平，綜合制定合適的仔豬豬瘟免疫程序。

3.4 豬瘟免疫程序應用實踐首免與二免后，豬場A優(yōu)化的免疫程序抗體水平極顯著（P＜0.01）高于原場免疫程序；首免后與二免后7d，豬場B優(yōu)化的免疫程序豬瘟抗體水平顯著（P＜0.05）高于原場免疫程序，二免后21 d、35 d、49 d，豬場B優(yōu)化的免疫程序豬瘟抗體水平極顯著（P＜0.01）高于原場免疫程序，說明優(yōu)化的豬瘟免疫程序較原場免疫程序好，仔豬不受母源抗體的干擾，產(chǎn)生較高且穩(wěn)定的豬瘟抗體水平，具有較好的抗豬瘟感染的保護力。羅勇等[16]研究對各試驗豬場進行超免和不超免的免疫程序的對比，發(fā)現(xiàn)豬瘟進行超免不會影響母源豬瘟抗體水平，但會導致哺乳仔豬在較長的時間里保持較高的豬瘟抗體水平，建議推遲首免時間，在60日齡左右進行加強免疫，生產(chǎn)豬群均產(chǎn)生較高的豬瘟抗體水平和免疫合格率，這些均與本試驗結果相似，說明優(yōu)化的豬瘟免疫程序較好，免疫后產(chǎn)生的豬瘟抗體具有較好的抗豬瘟感染的保護力。嚴達偉等[22]研究，正常仔豬豬瘟最佳首免日齡在14～28日齡。

試驗優(yōu)化的豬瘟免疫程序，仔豬豬瘟抗體合格率維持在一個較高的水平上。陳明凱等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在母源抗體水平較低的情況下免疫豬瘟傳代細胞源活疫苗，二免前豬瘟抗體水平呈略微上升或下降的趨勢，二免后豬瘟抗體水平呈快速上升的趨勢。查云峰等[23]研究發(fā)現(xiàn)，仔豬二免后，豬瘟抗體水平整體呈上升趨勢，豬瘟抗體合格率均在80%以上。這些試驗結果與本試驗結果相似。

豬場C按照優(yōu)化免疫程序進行豬瘟免疫后，機體豬瘟抗體水平維持在較高且穩(wěn)定的水平上，符合國家70%合格率的要求，說明優(yōu)化的豬瘟免疫程序可以在該地區(qū)選擇應用。

4 結論

確定優(yōu)化豬瘟免疫程序為首免21日齡，免疫劑量為2頭份，二免56日齡，免疫劑量為4頭份。二次加強免疫后，仔豬豬瘟抗體維持在較高的水平上，合格率高于國家要求的70%以上標準，持續(xù)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，豬瘟抗體水平可維持112 d。