印寶東，楊 曼，溫書志，李 紅，李 雪，張 彬，王麗杰，劉 野

（1.遼寧省盤錦市動(dòng)物疫病控制中心，遼寧 盤錦 124013；2.遼寧省盤錦市盤山縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 盤山 124100；3.遼寧省盤錦市盤山縣電商物流產(chǎn)業(yè)管理中心，遼寧 盤山 124100；4.遼寧省盤錦市大洼區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 盤錦 124200；5.遼寧省盤錦市濕地保護(hù)管理中心，遼寧 盤錦 124013）

禽流行性感冒，簡稱禽流感（Avian Influenza，AI），是由A型流感病毒引發(fā)的以感染禽類為主的傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為A類動(dòng)物疫病，我國將其列為一類動(dòng)物疫病。雞、火雞、鴨、鵝和鵪鶉等家禽及野鳥、水禽、海鳥等均可感染禽流感病毒。野生鳥類是禽流感病毒的天然宿主，帶毒候鳥可能隨著遷徙將禽流感病毒傳播到世界各地[2]。雙臺河口保護(hù)區(qū)濕地總面積8萬公頃，丹頂鶴、黑嘴鷗等260多種鳥類在這里棲息、繁殖。在東亞至澳大利亞候鳥遷徙路線上起著重要中轉(zhuǎn)站的作用[4]。多年來，本課題組密切關(guān)注雙臺子河口濕地遷徙、棲息的野生鳥類情況，通過持續(xù)監(jiān)測候鳥攜帶禽流感病毒情況并對病毒開展分子流行病學(xué)分析，為尋找我國禽流感病毒傳播規(guī)律提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 H5、H7、H9、A型流感病毒通用型熒光RT-PCR檢測試劑盒購自凱杰（匹基）生物工程（深圳）有限公司，高速冷離心機(jī)為德國，熒光PCR儀購自美國、生物安全柜為德國、移液器為美國，離心管、移液器槍頭等常規(guī)耗材為進(jìn)口。

1.2 樣品采集根據(jù)遼河河口自然保護(hù)區(qū)整個(gè)調(diào)查范圍內(nèi)的具體地貌、地勢和濕地分布情況，將樣品監(jiān)測采集范圍劃分為15個(gè)具有明顯可識別邊界的小區(qū)（見圖1）。在每個(gè)監(jiān)測小區(qū)中，選擇一處視野開闊的觀察點(diǎn)，對監(jiān)測范圍內(nèi)水禽進(jìn)行逐一識別和統(tǒng)計(jì)、記錄。樣品采集對象為監(jiān)測時(shí)段內(nèi)所見到的所有自然界活動(dòng)的野鳥，結(jié)合日常巡查針對撿拾死鳥尸體、合法捕獲進(jìn)行人工飼養(yǎng)的鳥類進(jìn)行檢測。隨時(shí)到合法飼養(yǎng)舍采集棉拭樣品和到候鳥集中棲息場所采集野鳥新鮮糞便樣品。根據(jù)春秋季節(jié)本區(qū)鳥類遷徙的特點(diǎn)，春季監(jiān)測時(shí)間主要集中在北遷雁鴨類、鶴鸛類和鸻鷸類遷徙高峰期，采樣時(shí)間集中在2月底～5月底；秋季監(jiān)測時(shí)間主要集中在南遷雁鴨類、鶴鸛類和鸻鷸類遷徙高峰期，采樣時(shí)間在7月下旬～11月下旬；每月開展1次采樣。采集的糞便或拭子樣品放入含10%甘油的PBS緩沖液中。

圖1 遼寧雙臺河口自然保護(hù)區(qū)監(jiān)測區(qū)分區(qū)圖[5]Fig.1Liaoning Shuangtaihekou natural reserve monitoring area partition diagram

表1 遼河口濕地樣品采集點(diǎn)分布Table 1Liaohekou wetland Sample collection point distribution

1.3 樣品檢測

1.3.1 檢測前樣品處理采集的糞便或拭子樣品保存管用振蕩器充分震蕩，讓拭子或糞便充分與緩沖液混合，然后小型臺式高速離心機(jī)12 000 r/min離心2 min，取上清用于樣品核酸提取。

1.3.2 樣品核酸提取 按照試劑盒說明書，每個(gè)樣品取200 μL（同時(shí)設(shè)立陽性和陰性對照樣品），加入600 μL裂解液，混勻，然后加入200 μL氯仿，混勻，4℃12 000 g離心15 min，取上清至另一個(gè)1.5 mL離心管中，加入400 μL的異丙醇，顛倒混勻。12 000 g離心15 min，棄上清，用600 μL 75%乙醇洗滌1次，離心棄上清，倒立離心管，自然烘干，每個(gè)樣品加11 μL的無RNA酶的DEPC水溶解RNA沉淀。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 熒光定量PCR檢測按照試劑盒說明書，在各設(shè)定的PCR管中分別加入上述樣本處理中制備的RNA溶液各10 μL，蓋緊管蓋，將PCR管排好放入PCR熒光檢測儀內(nèi)，進(jìn)行檢測，RT-PCR循環(huán)參數(shù)如下：42℃30 min，92℃30 min，1個(gè)循環(huán)；92℃10 s，45℃30 s，72℃1 min，5個(gè)循環(huán)；92℃10 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.4 陽性樣品的病毒分離鑒定對實(shí)驗(yàn)室檢測陽性的樣品送到國家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒分離鑒定，病毒分離陽性的樣品進(jìn)行序列測定和分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 樣品采集情況自2012年至2017年在雙臺子河口自然保護(hù)區(qū)的濕地、救助站內(nèi)、葦田等區(qū)域采集了4 278份樣品，其中野鳥樣品棉拭384份、野鳥尸體臟器39份、環(huán)境水樣500份、糞便3 355份，采集的樣品存放于含有PBS甘油的緩沖液系統(tǒng)內(nèi)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 樣品檢測結(jié)果采用凱杰（匹基）生物工程（深圳）有限公司提供的熒光定量PCR檢測試劑盒對提取的核酸進(jìn)行檢測，首先用通用型試劑盒檢測樣品中M基因的存在與否，來判定樣品中是否含有禽流感病毒，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4 278份樣品中有7份為流感監(jiān)測陽性，分別用H5、H7和H9亞型禽流感檢測試劑盒進(jìn)行亞型鑒定發(fā)現(xiàn)這5個(gè)樣品中有2個(gè)為H9陽性，2個(gè)為H5陽性，有1份樣品該三種試劑盒為陰性。

2.3 陽性樣品鑒定將該批檢測陽性樣品送到參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測，反饋結(jié)果表明：沒有鑒定出亞型的樣品為H6亞型禽流感病毒，對檢測陽性的H5樣品進(jìn)行病毒分離鑒定發(fā)現(xiàn)為H5N8或H5N2亞型，共鑒定出1株H5N8病毒亞型，1株H5N2病毒亞型，H5亞型禽流感病毒進(jìn)化分支為2.3.4分支，與韓國流行病H5N8毒株的HA基因相似性為99.5%，高度同源。

表2 2012～2017年不同時(shí)間監(jiān)測野鳥禽流感陽性分布Table 22012～2017 different time surveillance of wild birds avian influenza positive distribution

3 討論

雙臺河口保護(hù)區(qū)濕地作為多種野鳥的重要的棲息、繁殖地，同時(shí)也是世界上重要的候鳥遷徙帶。該濕地區(qū)域是東亞至澳大利亞候鳥遷徙路線上的一個(gè)重要中轉(zhuǎn)站，特殊的地理位置、良好的生態(tài)環(huán)境和特殊植被類型養(yǎng)育著豐富的動(dòng)物資源，是多種鳥類的理想棲息繁殖地和遷徙停歇地。這里是世界上最大的黑嘴鷗繁殖地，分布有黑嘴鷗12 000余只，其繁殖種群10 000余只，是名副其實(shí)的“黑嘴鷗之鄉(xiāng)”。眾所周知，野鳥作為禽流感病毒的最大天然宿主庫，在維持流感病毒的多樣性方面起著重要的作用。隨著候鳥的遷徙，禽流感病毒也隨著感染的野鳥不斷移動(dòng)，并隨著野鳥的生活活動(dòng)以及糞便的排放而污染野鳥活動(dòng)的區(qū)域環(huán)境，由于自然界中野鳥的活動(dòng)區(qū)域和水禽的活動(dòng)區(qū)域有著較大的重疊，容易導(dǎo)致病毒進(jìn)入水禽。是當(dāng)前家禽感染禽流感病毒的一個(gè)重要風(fēng)險(xiǎn)來源。

在盤錦市轄區(qū)范圍內(nèi)，水禽的飼養(yǎng)量較大，尤其是散養(yǎng)家禽較大，可以多達(dá)380萬羽，給候鳥與家禽之間增加了一個(gè)較大的密切接觸機(jī)會。韓國2014年前后連續(xù)多次發(fā)生禽流感疫情也表明，野鳥給該遷徙路線上的家禽帶來巨大的禽流感感染風(fēng)險(xiǎn)。本研究通過對盤錦地區(qū)野生鳥類進(jìn)行長達(dá)5年的禽流感監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)間和季節(jié)，野鳥攜帶的禽流感種類也不盡相同，野鳥可以攜帶多種不同的病毒，也可能攜帶傳播高致病性的禽流感病毒。通過對分離H5亞型禽流感病毒的HA基因的序列比較可以發(fā)現(xiàn)研究分離株的大多數(shù)基因與韓國毒株的親緣關(guān)系較近,說明在韓國和中國之間流感病毒通過候鳥存在頻繁的基因交流和交換。

從監(jiān)測結(jié)果看，家禽H5病毒感染與候鳥之間可能存在一定關(guān)聯(lián)，加強(qiáng)候鳥感染情況的調(diào)查與監(jiān)測，對做好高致病性禽流感預(yù)警預(yù)報(bào)工作具有促進(jìn)和指導(dǎo)作用。同時(shí)在家禽飼養(yǎng)管理方面應(yīng)注意做好圈舍的密封防護(hù)，安裝防鳥網(wǎng)設(shè)施，以及生物安全防隔離設(shè)施等，按程序做好免疫、定期開展消毒，嚴(yán)防病毒傳給家禽。每年數(shù)十萬只的野鳥于此停歇、棲息或繁殖，足以說明雙臺河口自然保護(hù)區(qū)在亞太地區(qū)野鳥保護(hù)上的重要位置，盤錦作為我國研究流感病毒傳播的前沿陣地具有重要的代表性，對公共衛(wèi)生安全也具有實(shí)際意義。