劉建波，田琳琳，李興華，白云龍，李 鑫，夏 成*，徐 闖，張洪友

（1.黑龍江省牡丹江市畜禽屠宰管理所，黑龍江 牡丹江 157011；2.黑龍江省大慶市畜禽屠宰管理所，黑龍江 大慶 163319；3.綏化市裕達(dá)牧業(yè)有限公司，黑龍江 綏化 157000；4.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319；5.武漢科立博牧業(yè)科技有限公司，湖北 武漢 430000）

奶牛酮病（Ketosis）是一種奶牛泌乳初期常見(jiàn)的一種營(yíng)養(yǎng)代謝病，以低血糖、高血酮、高血脂、酮尿、酮乳等為特征[1]。發(fā)病群體多為3～6胎次、產(chǎn)后2～6周、產(chǎn)奶量高的母牛[2]。在我國(guó)，奶牛酮病的發(fā)病率一直居高不下，高產(chǎn)奶牛亞臨床型酮病的發(fā)病數(shù)一般占產(chǎn)后母牛10%～30%，而臨床酮病的發(fā)生率的2%～20%[3]?；寂R床酮病的奶牛通常會(huì)食欲減退、產(chǎn)奶量下降、精神沉郁、體重下降，進(jìn)而導(dǎo)致奶牛治療費(fèi)用增加、泌乳量下降、繁殖性能降低從而造成牛場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)損失[4]。亞臨床酮病沒(méi)有明顯的臨床癥狀但也會(huì)造成經(jīng)濟(jì)損失，比如病牛在一個(gè)泌乳期同比正常時(shí)少產(chǎn)出1 000～1 500 kg牛奶[5]。因此，奶牛酮病越來(lái)越受到重視，而酮病的準(zhǔn)確和及時(shí)診斷或監(jiān)測(cè)為酮病的預(yù)防和治療具有重要意義。

奶牛體液中酮體主要有2%丙酮、20%乙酰乙酸和78%β-羥丁酸（BHBA）[6-7]。奶牛酮病的臨床診斷多以檢測(cè)血液、牛奶、尿液中占酮體含量比例最高的BHBA的含量作為診斷指標(biāo)[8]。其中依據(jù)血液中β-羥丁酸的含量分為：臨床型酮?。˙HBA＞1.5 mmol/L）以及亞臨床型酮?。?.5 mmol/L≥BHBA≥1.2 mmol/L）[9]。臨床型酮病有明顯的發(fā)病癥狀，亞臨床型酮病多無(wú)明顯癥狀，但確診只有通過(guò)生化檢測(cè)診斷。目前，酮體的檢測(cè)多種多樣，主要應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐的有以下幾種，對(duì)乳汁酮粉的定性檢測(cè)、尿酮體試劑帶定性檢測(cè)、血液血酮儀檢測(cè)法、血清BHBA生化分析儀檢測(cè)。血酮儀是方便快捷的測(cè)量方法，但是不同品牌血酮儀檢測(cè)效果不同，價(jià)格相差巨大。本研究選擇市面主要的血酮儀品牌雅培、怡成和BHBCheck血酮儀，對(duì)其應(yīng)用效果及價(jià)格進(jìn)行研究，以期為現(xiàn)場(chǎng)酮病檢測(cè)及防治提供多樣化的選擇。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)?zāi)翀?chǎng)試驗(yàn)在黑龍江省某集約化牛場(chǎng)開(kāi)展，該場(chǎng)按照中國(guó)泌乳奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行規(guī)范管理，自由采食全混合日糧（TMR），散欄式飼養(yǎng)。選取29頭3～6胎次、產(chǎn)后5～21 d泌乳奶牛作為試驗(yàn)動(dòng)物。該牧場(chǎng)采用阿菲牧牛場(chǎng)管理軟件（Afifarm，3.076 version，Israel）。

1.2 樣品采集與處理

1.2.1 血液樣品采集對(duì)選取的試驗(yàn)泌乳奶牛于清晨5:40進(jìn)行空腹尾靜脈采血。每頭牛采血量應(yīng)當(dāng)滿(mǎn)足3臺(tái)血酮儀和實(shí)驗(yàn)室生化分析儀檢測(cè)的需要量，大約10 mL。

1.2.2 處理對(duì)于采得的血液樣品，無(wú)需加入抗凝劑，全血直接用于血酮儀檢測(cè)；剩余的血液亦不需加入抗凝劑，并于30 min內(nèi)進(jìn)行離心，離心轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心時(shí)間5 min，離心血清裝于1.5 mL離心管，使用液氮速凍并儲(chǔ)存于-20℃以備用于實(shí)驗(yàn)室生化分析儀檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)

1.3.1 血酮儀檢測(cè)3種血酮儀的檢測(cè)方法相同，均可參照以下方法。首先將試紙條插入血酮儀的試紙孔中，等顯示屏上顯示“進(jìn)血”后，再將試管中的全血適量滴入到試紙條小口處，儀器通過(guò)虹吸作用將血液吸入進(jìn)行檢測(cè)，等待約30 s后，觀察并記錄顯示屏數(shù)據(jù)。

1.3.2 生化分析儀檢測(cè)將所得1.5 mL離心管中的血清解凍后，用于全自動(dòng)生化儀檢測(cè)。BHBA生化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自英國(guó)朗道。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件分析。3種血酮儀與生化檢測(cè)BHBA試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析；以生化檢測(cè)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行ROC曲線(xiàn)分析，得到3種血酮儀檢測(cè)的敏感性和特異性。

2 結(jié)果

2.1 相關(guān)性分析表1可知，3種血酮儀測(cè)定BHBA含量與生化儀測(cè)定含量均呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性。怡成與生化分析的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性為0.993（P＜0.01），BHBCheck與生化分析儀的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性為0.936（P＜0.01）,雅培與生化分析儀的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性為0.993（P＜0.01）。比較3種血酮儀測(cè)得的BHBA含量與實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的含量，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即這3種血酮儀測(cè)得的BHBA均能準(zhǔn)確反映生化分析儀測(cè)定的BHBA水平。

表1 3種血酮儀測(cè)定BHBA與生化儀測(cè)定BHBA含量的相關(guān)性Table 1Determination of Correlation between BHBA and Biochemical Analyzer for Determination of BHBA Content by Three Blood Ketone Analyzers

2.2 交叉表3種血酮儀與生化儀的交叉制表分別列于表2、表3、表4。根據(jù)這些數(shù)據(jù)得出3種儀器的敏感度、特異度、正確率和Youden指數(shù)于表5。BHBCheck血酮儀除特異度與其他2種血酮儀相同為100%外，敏感度、準(zhǔn)確率、Youden指數(shù)等3項(xiàng)指標(biāo)均高于另外2種血酮儀。

表2 雅培*生化儀交叉表Table 2Yapei*Biochemical Analyzer Crosstab

表3 怡成*生化儀叉制表Table 3Yicheng*Biochemical Analyzer Crosstab

表4 BHBCheck*生化儀交叉制表Table 4 BHBCheck*Biochemical Analyzer Crosstab

表5 3種血酮儀四項(xiàng)指標(biāo)的對(duì)比Table 5Comparison of four indicators of three kinds of Blood Ketone Meters

2.3 ROC曲線(xiàn)分析

圖1 ROC曲線(xiàn)Fig.1ROC curve

表6 ROC曲線(xiàn)下面積Table 6 ROC area under the curve

檢驗(yàn)結(jié)果變量：雅培、科立博、怡成在正的和負(fù)的實(shí)際狀態(tài)組之間至少有一個(gè)結(jié)。統(tǒng)計(jì)量可能會(huì)出現(xiàn)偏差。a：在非參數(shù)假設(shè)下；b：零假設(shè)；實(shí)面積=0.5。3種血酮儀的ROC曲線(xiàn)如圖1，3種血酮儀的曲線(xiàn)下的面積（AUC）如表6。怡成的AUC最小為0.875；其次是雅培為0.938；BHBCheck的AUC最大為0.969。

3 討論

常用的奶牛酮病診斷方法有酮體試紙條、血酮儀檢測(cè)法、血液BHBA生化分析儀和酮粉法。其中，血液BHBA生化分析儀法是一種高靈敏度的以血清為樣本的檢測(cè)方法[10]，但同時(shí)也存在著諸多缺點(diǎn)，比如這種方法需要在生化儀進(jìn)行，檢測(cè)程序復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)檢測(cè)人員的技能要求高，不適合生產(chǎn)實(shí)踐大量檢測(cè)，價(jià)格大約為10元/例。酮體試紙條的檢測(cè)材料是尿液或乳汁，是一種靠比色卡進(jìn)行定性的檢測(cè)[11]，檢測(cè)準(zhǔn)確性較低，價(jià)格為6元/例。尿液酮體含量測(cè)定波動(dòng)較大，準(zhǔn)確性小，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性；乳液中的酮體波動(dòng)較小，測(cè)定的結(jié)果可靠準(zhǔn)確，但敏感性和特異性較差[12]，一般靈敏度和準(zhǔn)確性只有60%。酮粉法檢測(cè)是以乳汁為檢測(cè)材料。酮粉法檢測(cè)雖然價(jià)格低廉價(jià)格為0.6元/例，但是只能做定性檢測(cè)而不能做定量檢測(cè)，特異性和靈敏度均較低亦不能作為牛場(chǎng)酮病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的依據(jù)。血酮儀是一種以全血作為檢測(cè)材料的檢測(cè)方法，價(jià)格為平均為19元/例。血酮儀相對(duì)于生化儀操作簡(jiǎn)單，相對(duì)于試紙條準(zhǔn)確，相對(duì)于酮粉來(lái)說(shuō)敏感性高。雖然價(jià)格偏高，但是未來(lái)規(guī)模集約化牛場(chǎng)應(yīng)當(dāng)多以使用方便快捷、敏感性高的血酮儀為主。依據(jù)本試驗(yàn)選擇出目前市售性能最好，價(jià)格最低的血酮儀，顯得具有重要意義。

亞臨床酮病發(fā)病率10%～30%，病牛每個(gè)泌乳期在奶制品上的收益和花在治療上的損失約151～312美元[13]。對(duì)亞臨床酮病的預(yù)警可以有效地降低牛場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)損失，比如BHBA≥1.2 mmol/L判定為亞臨床酮病，用血酮儀測(cè)得多頭奶牛的BHBA含量為1.0 mmol/L左右，十分接近亞臨床酮病的1.2 mmol/L，由此判定牛群有極大的可能性會(huì)患酮病。需要進(jìn)行及時(shí)治療，或者改變飼料配方，預(yù)防酮病的發(fā)生，從而達(dá)到防治酮病減少損失的目的。

對(duì)于牛場(chǎng)來(lái)說(shuō)，酮病的檢測(cè)要既精確又操作簡(jiǎn)單，還要符合牛場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。ROC曲線(xiàn)結(jié)果可以體現(xiàn)出檢測(cè)指標(biāo)的靈敏度和準(zhǔn)確度[14]。當(dāng)AUC在0.5～0.7時(shí)有較低準(zhǔn)確性，AUC在0.7～0.9時(shí)有一定準(zhǔn)確性，AUC在0.9以上時(shí)有較高準(zhǔn)確性[15]。怡成AUC最小，診斷效果最差，但有一定的準(zhǔn)確性；其次是雅培，診斷準(zhǔn)確性較高；BHBCheck AUC最大，準(zhǔn)確性非常高。3種血酮儀檢測(cè)結(jié)果比較而言，BHBCheck血酮儀的診斷價(jià)值最高。使用血酮儀檢測(cè)一個(gè)樣本，雅培30元/例，BHBCheck 23元/例，怡成約是15元/例。所以BHBCheck血酮儀的價(jià)格與診斷價(jià)值相對(duì)更符合牛場(chǎng)生產(chǎn)實(shí)踐要求，而怡成血酮儀因其價(jià)格較底，適合集約化牧場(chǎng)大規(guī)模的酮病普查。

但血酮儀并不是適合所有的牛場(chǎng)，大型集約化和散戶(hù)有不同的選擇。一般大型牛場(chǎng)集約化程度高，資金雄厚，檢測(cè)數(shù)量多，對(duì)檢測(cè)的精確性要求高，主要以預(yù)防為主，因此可以采用血酮儀作為檢測(cè)儀器。散戶(hù)奶牛數(shù)量少，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性要求低，資金緊張，也可以采用酮粉進(jìn)行檢測(cè)法。

4 結(jié)論

3種血酮儀中，BHBCheck的檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)性高、檢測(cè)敏感性高，診斷參考價(jià)值高，價(jià)格相對(duì)較低。因此BHBCheck更適合用于牧場(chǎng)酮病的輔助診斷，而怡成因其價(jià)格較低適用于大型集約化牛場(chǎng)大規(guī)模的酮病檢測(cè)。