周斌，王靜，周其洋，童星

(佛山市海天(高明)調(diào)味食品有限公司，廣東 佛山，528500)

米曲霉在東方傳統(tǒng)釀造食品中的應(yīng)用已經(jīng)有上千年歷史，是中國及日本醬油等發(fā)酵產(chǎn)品的主要生產(chǎn)菌株，其安全性已經(jīng)得到美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)[1-2]和世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)[3]的認(rèn)可。在這些食品發(fā)酵過程中，米曲霉能夠分泌大量的蛋白水解酶和糖類水解酶，并將大豆和小麥等原料降解成短肽、氨基酸、寡糖及單糖，這些小分子物質(zhì)是提供產(chǎn)品風(fēng)味的源泉。在中國，醬油釀造一般使用米曲霉滬釀3.042[4]；而日本則多采用米曲霉和醬油曲霉混合菌種發(fā)酵。日本龜甲萬中央研究院研究表明，日本釀造企業(yè)使用菌種中有74%是兩種以上的菌株混合，同時(shí)菌株種類79%為米曲霉，21%為醬油曲霉[5]。為獲得性狀優(yōu)良的菌株，菌種的選育和持續(xù)改良貫穿于整個(gè)發(fā)酵過程，是現(xiàn)代發(fā)酵菌種技術(shù)的核心內(nèi)容。但目前傳統(tǒng)釀造行業(yè)中米曲霉菌株的研究大部分還停留在表觀研究階段，即通過最終酶活力來表觀菌株的發(fā)酵性能，對(duì)于酶活力究竟是怎么來的，如何分泌，有哪些基因調(diào)控，很少有人去深究。我們希望通過綜述米曲霉基因組，以及基因與酶系蛋白表達(dá)之間的關(guān)系，使人們能夠更加深入地了解米曲霉基因組和酶系基因的組成特點(diǎn)及作用機(jī)制，為將米曲霉更好地應(yīng)用于傳統(tǒng)釀造食品提供指導(dǎo)。

1 米曲霉基因組研究現(xiàn)狀

NCBI數(shù)據(jù)庫中將基因組組裝完整度由好到差依次分為Complete、Chromosome、Scaffold及Contig四個(gè)等級(jí)。2017 年11 月 10日在NCBI中對(duì)真菌(Fungi)基因組進(jìn)行檢索分析，發(fā)現(xiàn)達(dá)到4種組裝水平的基因組數(shù)量為2 672條，曲霉屬有91條，僅占真菌總量的3.4%。沒有曲霉屬菌株基因組組裝程度達(dá)到Complete水平；僅有煙曲霉Af293(2005 年完成)和構(gòu)巢曲霉FGSCA4(2008 年完成)的基因組達(dá)到Chromosome水平；41 條曲霉基因組記錄達(dá)到Scaffold水平，其中僅有1條記錄是米曲霉菌株(米曲霉RIB40，2005 年完成)，1條是醬油曲霉菌株(醬油曲霉NBRC4239，2011 年完成)；48 條曲霉基因組記錄達(dá)到Contig水平，其中8條是米曲霉，分別是3.042(2012 年完成)、AS 3.951(2012年完成)、AS 3.863(2012 年完成)、RIB326(2012年完成)、100-8(2014年完成)、BCC7051(2017年完成)、SRCM101975(2017年完成)、SRCM101989(2017年完成)。從以上數(shù)據(jù)可以看出，雖然曲霉的基因組學(xué)研究在真菌領(lǐng)域占比較少，基因組組裝水平不高，但就是這些不算完美的基因組信息卻在實(shí)際應(yīng)用中極大推進(jìn)了基因改造技術(shù)的發(fā)展。

2005年，日本26 家科研單位利用全基因組鳥槍法共同測(cè)序完成了世界首例釀造用米曲霉RIB40基因組序列[6]。測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，米曲霉基因組大小為37.6 Mb，分布在8條不同的染色體上，長度分別是6.4 Mb、6.2 Mb、5.0 Mb、4.8 Mb、4.4 Mb、4.1 Mb、3.4 Mb和3.3 Mb；七號(hào)染色體上還包含0.6 Mb的rDNA重復(fù)序列；線粒體序列為2.9 kb?；虻钠骄笮?.8 kb，是釀酒酵母基因大小的1.4倍。在最新的曲霉基因組數(shù)據(jù)庫中[7](截止2017年11月12 日)，米曲霉 RIB40基因組中預(yù)測(cè)的編碼蛋白基因是12 090個(gè)(基因組基因12 074個(gè)，線粒體基因16 個(gè))，其中僅有205 個(gè)基因功能是經(jīng)過證實(shí)，占基因總數(shù)的1.7%。在8條染色體上分別分布著2 048、2 019、1 655、1 528、1 487、1 320、908和1 097個(gè)基因，同時(shí)還有12 個(gè)基因位于8條染色體以外的序列上。除此之外，米曲霉基因組上還有268 個(gè)tRNA序列和3 個(gè)rRNA序列。進(jìn)一步對(duì)米曲霉基因組基因進(jìn)行GO功能聚類分析發(fā)現(xiàn)(圖1所示)，在分子功能聚類中排名前3位為水解酶活力(hydrolase activity)、氧化還原酶活力(oxidoreductase activity)和轉(zhuǎn)運(yùn)酶活力(transferase activity)，基因數(shù)均超過1 000(超過注釋基因的8%)，同時(shí)肽酶活力(peptidase activity)基因個(gè)數(shù)達(dá)到206；在細(xì)胞組分聚類中排名前3位為細(xì)胞核(nucleus)、膜(membrane)和細(xì)胞質(zhì)(cytosol)，均有超過1 400個(gè)基因(超過注釋基因的10%)；而在生物過程聚類中則有大量基因參與了糖類代謝(455個(gè))、蛋白質(zhì)和氨基酸代謝(401個(gè))、脂類代謝(398 個(gè))以及分泌蛋白加工轉(zhuǎn)運(yùn)(2 681個(gè))等過程。到目前為止,雖然米曲霉基因組中絕大部分基因的具體功能還是未知的，但從圖1相對(duì)全面的注釋數(shù)據(jù)來看，米曲霉是一種非常適合用于醬油等傳統(tǒng)食品釀造的微生物。

米曲霉RIB40基因組測(cè)序完成之后，就陸續(xù)有針對(duì)其自身及其他品類米曲霉基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白組研究成果的相關(guān)報(bào)道。VONGSANGNAK等[8]應(yīng)用表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)分析米曲霉A1560基因組，鑒定了1 046個(gè)新基因；同時(shí)對(duì)米曲霉基因組數(shù)據(jù)庫中1 469個(gè)假定蛋白功能進(jìn)行新的預(yù)測(cè)，并利用修訂后的基因組注釋重構(gòu)了米曲霉代謝網(wǎng)絡(luò)。WANG等[9]利用RNA-Seq測(cè)序技術(shù)對(duì)米曲霉進(jìn)行不同培養(yǎng)條件的轉(zhuǎn)錄分析，判定12 074個(gè)蛋白編碼基因中有11 263個(gè)發(fā)生轉(zhuǎn)錄表達(dá)，使得米曲霉基因的注釋率達(dá)到93.28%；確定了4 198個(gè)基因的5′非翻譯區(qū)(5′-Untranslated Region，5'UTR)和4 357個(gè)基因的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)；確認(rèn)了1 345個(gè)米曲霉基因的上游開放閱讀框(Upstream Open Reading Frame，uORF)和272個(gè)基因的上游起始密碼子(uATG)，發(fā)現(xiàn)了1 166 個(gè)新轉(zhuǎn)錄本和800個(gè)新外顯子；確定了1 375個(gè)可變剪接事件。ZHAO等[10]通過比較米曲霉100-8和米曲霉3.042蛋白組學(xué)差異，鑒定出522 個(gè)胞內(nèi)蛋白，并發(fā)現(xiàn)部分與碳及氨基酸代謝有關(guān)的蛋白可能會(huì)促進(jìn)醬油風(fēng)味；后續(xù)又通過比較分析米曲霉100-8和米曲霉3.042基因組與轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)差異，獲得了2株菌在基因組水平上單核苷酸多態(tài)性、缺失及插入序列位點(diǎn)信息，轉(zhuǎn)錄組水平上的胞外蛋白酶差異表達(dá)基因，在基因水平揭示了2種米曲霉不同的分泌調(diào)控機(jī)制和由其導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味不同的原因[11]。因此通過對(duì)基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白組綜合比較分析研究，使大家從全局上對(duì)米曲霉基因組信息及基因功能有了更加清晰的認(rèn)識(shí)。

2 米曲霉水解酶

在傳統(tǒng)食品釀造過程中，米曲霉能夠分泌大量水解酶類，主要包括蛋白水解酶(蛋白酶、肽酶、谷氨酰胺酶)和糖類水解酶(淀粉酶、葡萄糖苷酶、蔗糖酶、植物水解酶)[12]。這兩大類酶系能夠?qū)⒃现械牡鞍踪|(zhì)及糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)變成多肽、氨基酸、寡糖及單糖，這些小分子物質(zhì)是構(gòu)成傳統(tǒng)發(fā)酵食品色、香、味、體的源泉[5]。但目前對(duì)于蛋白水解酶和糖類水解酶研究主要是集中在酶學(xué)性質(zhì)(包括：酶組分、酶學(xué)性質(zhì)、影響酶活因素)的研究[13-15]；而對(duì)控制這些酶系表達(dá)基因的關(guān)注度不高，因此下面就從基因水平對(duì)這兩大酶系進(jìn)行詳細(xì)闡述。

2.1 蛋白水解酶

蛋白水解酶包括內(nèi)肽酶及外肽酶。大部分內(nèi)肽酶可以根據(jù)催化活性中心分成4大類[16]，即絲氨酸肽酶(serine endopeptidase)、半胱氨酸肽酶(cysteine endopeptidases)、天冬氨酸肽酶(aspartic endopeptidase)和金屬肽酶(metalloendopeptidase)。雖然每個(gè)類別肽酶的底物結(jié)合位點(diǎn)不同，但活性中心催化位點(diǎn)周圍氨基酸序列卻相對(duì)保守，因此這些保守的序列信息就被用來鑒別米曲霉不同的肽酶基因(表1所示)。

表1 米曲霉基因組肽酶基因數(shù)量及氨基酸保守序列[6, 17]Table 1 The number of genes and conserved amino acid sequences of the peptidases in A. oryzae

外肽酶根據(jù)作用方式劃分為氨肽酶(Aminopeptidases)、二肽酶(Dipeptidases)、二肽或三肽酶(Dipeptidyl or Tripeptidyl peptidases)以及羧肽酶(Carboxypeptidases)，米曲霉外肽酶基因的預(yù)測(cè)是通過與公開數(shù)據(jù)庫已知外肽酶基因信息進(jìn)行比對(duì)獲得(COGscores>150)[17]。對(duì)米曲霉的基因組整體預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)(表1所示)，米曲霉基因組上存在135 個(gè)肽酶基因，其中包含69 個(gè)外肽酶基因和66 個(gè)內(nèi)肽酶基因，占到米曲霉總基因數(shù)的1%[6]。而且米曲霉肽酶基因數(shù)量還遠(yuǎn)超過構(gòu)巢曲霉(90 個(gè))和煙曲霉(99 個(gè))[6]。米曲霉基因組上有大量在酸性pH條件下發(fā)揮作用的分泌型肽酶基因，包括天冬氨酸蛋白酶、抑肽素鈍化蛋白酶(Pepstatin insensitive protease)、奧瑞素(Aorsin)、羧肽酶，這也許可以解釋為什么米曲霉適合在酸性pH條件下生長。通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)[17]，半數(shù)以上金屬蛋白酶(Metalloproteinases)，大部分天冬氨酸蛋白酶(Aspartic proteinases)和絲氨酸型羧肽酶(Serine-type carboxypeptidases)都有一個(gè)典型的信號(hào)肽序列，可初步判定為分泌型蛋白酶。從這些數(shù)據(jù)分析可以看出，米曲霉具有豐富的分泌型肽酶，該特性使其被選擇用于富含蛋白質(zhì)原料的發(fā)酵應(yīng)用。BUDAK等[16]通過綜合分析米曲霉RIB40等7種曲霉在麥麩和甜菜渣2種培養(yǎng)條件下基因組、蛋白組以及酶學(xué)檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)7種曲霉均含有大約占總基因數(shù)量3%(預(yù)測(cè)蛋白酶基因數(shù)量均超過300 個(gè)，胞外蛋白酶超過40 個(gè))的蛋白酶基因，其中25%±1%屬于絲氨酸蛋白酶，18%±1%屬于金屬蛋白酶，8%±1%屬于氨基蛋白酶，5%屬于天冬氨酸蛋白酶。對(duì)7種曲霉蛋白組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，總共133種假定的蛋白酶基因被確認(rèn)，其中米曲霉基因組上含有41個(gè)直系同源蛋白酶基因，包括5種氨基蛋白酶、7種天冬氨酸肽酶、1種半胱氨酸酶、6種金屬蛋白酶、17種絲氨酸蛋白酶和5種泛素化蛋白酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明,麥麩較甜菜渣能更好地誘導(dǎo)蛋白酶基因表達(dá)。但是通過最新曲霉數(shù)據(jù)庫[7]檢索發(fā)現(xiàn)，目前僅有21種肽酶基因得到詳細(xì)的功能研究(pamA、pepAd、opsA、ocpO、ocpC、cdpA、damA、gdaA、lapA、apsB、apsA、mepB、dppIV、kexA、sedD、atg4、nptB、alpA、pepE、kexB、creB)。這說明目前蛋白酶系基因的研究主要側(cè)重于生物信息學(xué)方面的序列比較分析，要想更深入了解酶系基因的作用機(jī)理，則需要進(jìn)一步對(duì)這些預(yù)測(cè)基因進(jìn)行詳細(xì)的功能性研究。

2.2 糖類水解酶

米曲霉不僅能用于醬油及發(fā)酵醬的生產(chǎn)，在日本還被用于酒類產(chǎn)品的發(fā)酵，包括清酒及燒酒，而且也有上千年的歷史，這主要是利用米曲霉豐富的糖類水解酶[18]。米曲霉的淀粉水解酶包含α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和α-葡萄糖苷酶，到目前為止大部分淀粉水解酶的基因功能已經(jīng)被證實(shí)[19]。KOBAYASHI等[17]對(duì)米曲霉RIB40的基因組進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，米曲霉基因組上有5個(gè)α-淀粉酶、2個(gè)葡萄糖淀粉酶和5個(gè)胞外α-葡萄糖苷酶基因。與蛋白水解酶相比，淀粉水解酶的基因數(shù)量遠(yuǎn)小于預(yù)期，但就是這些相對(duì)少量的基因卻保證了米曲霉強(qiáng)大的淀粉水解能力。米曲霉基因組上還存在大量的果膠水解酶基因(55 個(gè))[6]，但實(shí)際生長過程中的果膠水解能力并不強(qiáng)。其中糖基水解酶結(jié)合域的數(shù)量決定了原料生物質(zhì)的分解能力[20-21]，但通過基因分析發(fā)現(xiàn)米曲霉含有纖維素結(jié)合域(cellulose binding domain，CBD)或淀粉結(jié)合域(starch binding domain，SBD)的基因數(shù)量是明顯偏少；構(gòu)巢曲霉中有19 個(gè)水解酶含有CBD結(jié)合域，但米曲霉只有5個(gè)水解酶含有CBD結(jié)合域；黑曲霉的淀粉酶和至少一個(gè)葡萄糖苷酶有SBD結(jié)合域，但米曲霉中只有g(shù)laA含有SBD結(jié)合域[17]。通過上述結(jié)果可以支持這樣的假說[22]：米曲霉來源于野生的植物致病菌，但在長期馴化過程中利用容易分解的原料，導(dǎo)致果膠、纖維素以及生淀粉水解能力逐漸退化。COUTINHO等[23]利用CAZy family數(shù)據(jù)庫對(duì)米曲霉RIB40基因組預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)基因組上存在219 個(gè)糖類水解酶基因，其中71.7%(157 個(gè))有分泌信號(hào)，17.8%(39 個(gè))是非經(jīng)典分泌，10.5%(23 個(gè))是在胞內(nèi)發(fā)揮作用。通過作用功能歸類分析，米曲霉基因組中有33 種糖苷酶，總計(jì)185 個(gè)基因；有5種多糖裂解酶，總計(jì)20 個(gè)基因；有3種糖類酯酶，共計(jì)14 個(gè)基因。由于多糖較蛋白質(zhì)組成成分簡單，目前糖類水解酶基因功能研究水平較蛋白水解酶相對(duì)全面。

3 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

只通過酶系基因數(shù)量來衡量水解酶表達(dá)量的豐富程度具有一定局限性。在同等基因數(shù)量的前提下，不同培養(yǎng)時(shí)間及培養(yǎng)條件的酶系表觀活力是不一致的，這主要是轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)基因?qū)崟r(shí)調(diào)控造成的。轉(zhuǎn)錄因子是通過與受調(diào)控基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件發(fā)生相互作用來影響基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在FTFD數(shù)據(jù)庫(fungal transcription factor database)中有570 個(gè)基因被預(yù)測(cè)為轉(zhuǎn)錄因子[24]。COUTINHO等[23]通過總結(jié)分析認(rèn)為多糖水解酶的基因表達(dá)主要是受AbaA(AO090003001587)、AmyR(AO090003 001208)、AreA(AO090009000502)、BrlA(AO090005 001041)、CreA(AO090026000464)、PacC(AO090003 000758)、PecR、XlnR(AO090012000267)幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。CreA是碳分解代謝物阻遏蛋白[25]，在葡萄糖或其他易代謝碳源存在條件下，抑制大部分糖類水解酶基因表達(dá)，例如淀粉水解酶等。AmyR是淀粉水解轉(zhuǎn)錄激活因子[26]，α-淀粉酶、糖化酶及α-葡萄糖苷酶基因都是受AmyR轉(zhuǎn)錄因子激活調(diào)控。XlnR是木聚糖以及纖維素水解的轉(zhuǎn)錄激活因子[27]，幾乎調(diào)控表達(dá)了所有參與木聚糖和纖維素降解基因，以及部分參與木葡聚糖和半乳甘露聚糖降解基因。PecR是預(yù)測(cè)參與果膠分解的轉(zhuǎn)錄激活因子[28]，目前其具體功能還未進(jìn)行詳細(xì)研究。還有一些多糖水解酶基因是由銨鹽相關(guān)調(diào)控因子AreA[29]以及pH調(diào)控蛋白PacC[17, 30]調(diào)控。另外在參與多糖降解基因的啟動(dòng)子上還發(fā)現(xiàn)有發(fā)育調(diào)控因子AbaA[31]和BrlA[32]結(jié)合位點(diǎn)，但這些轉(zhuǎn)錄因子在糖類代謝中具體作用效果并未得到詳細(xì)評(píng)估[23]。目前對(duì)于蛋白水解酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的研究較少，只有一個(gè)得到較為詳細(xì)研究，PrtT[33-34](AO090003001577)，該調(diào)控因子在米曲霉中參與了中性金屬蛋白酶(NpI)以及堿性絲氨酸蛋白酶(AIp)等蛋白酶基因的表達(dá)調(diào)控。除了這些專屬的轉(zhuǎn)錄因子外，還有一些全局性轉(zhuǎn)錄因子，也參與了分泌酶系基因的表達(dá)調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子FlbC[35](AO090026000200)不僅參與了孢子的發(fā)育調(diào)控，還參與了固態(tài)培養(yǎng)條件下葡萄糖淀粉酶以及蛋白酶基因的特異表達(dá)調(diào)控。轉(zhuǎn)錄激活因子CpcA[36](AO090009000459)參與到氨基酸生物合成途徑，在所有米曲霉轉(zhuǎn)錄因子中的相對(duì)表達(dá)水平最高。轉(zhuǎn)錄因子HacA[34](AO090124000074)參與到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)分子伴侶、磷脂代謝、脂肪酸合成、易位、蛋白糖基化、細(xì)胞壁合成、膜泡運(yùn)輸、液泡蛋白定位和蛋白降解等過程。正由于這些特異性以及全局性轉(zhuǎn)錄因子對(duì)糖類及蛋白水解酶基因的動(dòng)態(tài)調(diào)控表達(dá)，保證了米曲霉在不同環(huán)境條件下最優(yōu)生長。

4 蛋白分泌途徑

在傳統(tǒng)食品釀造過程中主要是利用米曲霉的分泌型糖類及蛋白水解酶來進(jìn)行原料的降解。這些分泌酶基因經(jīng)過復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及分泌途徑的熟成加工，最終形成具有作用功能的酶系蛋白。已有研究表明米曲霉等絲狀真菌的蛋白分泌一般發(fā)生在菌絲頂端或亞頂端即頂端分泌，這種分泌方式在一定程度上決定了米曲霉高效分泌能力[37-38]。在蛋白分泌過程中，分泌蛋白相應(yīng)的mRNA首先在核糖體上合成為多肽并靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)；隨后多肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行折疊與修飾，例如糖基化、形成二硫鍵、磷酸化以及亞基組裝，發(fā)生錯(cuò)誤折疊蛋白會(huì)激活非折疊蛋白反饋機(jī)制(unfolded protein response，UPR)或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解(endoplasmic reticulum associated degradation，ERAD)；接著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中正確折疊蛋白通過囊泡運(yùn)輸轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體(golgi)，在高爾基體中進(jìn)一步對(duì)蛋白進(jìn)行成熟加工以及糖基化；高爾基體中加工蛋白可能會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡(vacuole)降解；分泌蛋白則通過囊泡運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜并分泌到細(xì)胞外[34]。蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體以及細(xì)胞膜等細(xì)胞器之間的傳輸是通過囊泡運(yùn)輸實(shí)現(xiàn)，其中SNARE蛋白是囊泡運(yùn)輸中核心蛋白。在米曲霉基因組上有大約21 種不同SNARE蛋白基因[39]，這些蛋白是水解酶蛋白正常分泌的重要保證。LIU等[40]對(duì)米曲霉基因組通過文獻(xiàn)總結(jié)和生物信息學(xué)分析，獲得目前最為全面示蹤米曲霉分泌機(jī)制的369 個(gè)分泌途徑組分基因，這些基因蛋白協(xié)同參與了蛋白分泌途徑的所有步驟和過程，保證了酶系蛋白在分泌系統(tǒng)中的高效翻譯、高效組裝修飾以及高效分泌。

5 結(jié)語

米曲霉不僅是傳統(tǒng)食品釀造行業(yè)中的核心菌株，而且還被廣泛應(yīng)用于外源蛋白的表達(dá)宿主，LUBERTOZZI和KEASLING[41]統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)大約商業(yè)酶總量的50%是由米曲霉、黑曲霉以及李氏木霉等絲狀真菌生產(chǎn)。自2005 年米曲霉RIB40基因組測(cè)序完成之后，米曲霉分子遺傳改造效率就得到大幅度提高，YOON等[42]在米曲霉中實(shí)現(xiàn)了10 個(gè)蛋白酶基因的連續(xù)敲除，并以其作為宿主進(jìn)行人溶菌酶(human lysozyme，HLY)和牛凝乳酶(bovine chymosin，CHY)異源表達(dá)，其表達(dá)量分別是野生型的3.2 倍和3.8 倍。同時(shí)對(duì)米曲霉進(jìn)行基因組改造不僅能實(shí)現(xiàn)多達(dá)200 kb超大片段敲除[3]，還能實(shí)現(xiàn)單個(gè)堿基精確刪除和插入[43]，利用這些技術(shù)可以用來破壞對(duì)工業(yè)生產(chǎn)不利的基因，改善米曲霉生產(chǎn)效率。后續(xù)隨著組學(xué)新技術(shù)在米曲霉中應(yīng)用，米曲霉將會(huì)朝著多組學(xué)協(xié)同研究的方向發(fā)展，在基因水平、轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)表達(dá)和代謝物分泌水平不同維度上系統(tǒng)分析細(xì)胞反應(yīng)和調(diào)控機(jī)理，將有助于我們更加全面地理解米曲霉蛋白分泌調(diào)控機(jī)制，為米曲霉酶系表達(dá)研究提供全面的理論指導(dǎo)。

由于基因組學(xué)現(xiàn)代遺傳改造技術(shù)應(yīng)用于傳統(tǒng)食品釀造菌株的改造存在諸多限制，導(dǎo)致一直以來只能使用傳統(tǒng)的物理及化學(xué)方法進(jìn)行米曲霉育種研究。傳統(tǒng)的菌種選育方式具有很大的盲目性和隨機(jī)性，選育效率非常低。同時(shí)對(duì)于菌種選育過程中菌株性能評(píng)價(jià)，只簡單的通過酶活力表觀指標(biāo)進(jìn)行衡量，沒有深入的理解和探究酶系相關(guān)基因?qū)τ诰N發(fā)酵性能的根本影響，評(píng)價(jià)結(jié)果往往具有一定的片面性。因此在我國后續(xù)的菌種研究過程中，如何有效利用基因組所包含的基因信息來指導(dǎo)和提高米曲霉菌種的選育效率以及尋找最適發(fā)酵條件，將會(huì)是一個(gè)值得深究的課題。